3 結果與分析
3.1 白木香C4H基因的克隆
根據高通量測序結果，以白木香的cDNA為模板，利用PCR方法擴增獲得1個1 515 bp的基因序列，編碼504個氨基酸，GenBank 登陸號KF134783。白木香C4H 基因PCR擴增。基因命名為C4H，將其連接pGM-T 載體轉化到大腸杆菌TOP10，測序結果經NCBI的Blast比對，確定其擴增產物為白木香C4H基因cDNA的片段。
M.DL2000 DNA marker； 1.PCR 產物。
3.2 C4H的生物信息學分析
3.2.1 C4H蛋白的理化特性分析 利用ExPASy Proteomics Server 的在線軟件Protparam對C4H蛋白的理化性質進行預測分析。推測其分子式為C2616H4140N722O725S16，相對分子質量 57.819 01 kDa，等電點pI 8.78。帶正電殘基（Arg+Lys） 65，負電殘基（Asp+Glu） 60。該蛋白的不穩定係數為50.98，脂肪係數為99.78，親水性係數為-0.184。
3.2.2 C4H跨膜區及三維結構預測 用TMHMM2.0預測C4H跨膜區域。蛋白含有2個跨膜螺旋結構，分別位於9～27位和445～463位氨基酸之間。由分析軟件建立的C4H三維結構模型。
3.2.3 C4H氨基酸序列的分子係統進化分析 利用NCBI在線BLAST工具，將C4H與GenBank中18種植物的C4H蛋白進行比對，C4H蛋白與欖樹、黃瓜等植物的C4H蛋白相似性達90%。通過MEGA 4軟件采用相鄰連接法構建C4H進化樹，進行聚類關係分析。
3.3 白木香C4H基因在不同傷害處理時間的表達分析
健康的白木香隻有受到外界傷害後才能產生沉香類物質。研究表明，機械傷害和化學刺激都能夠誘導相關物質的產生[3-4]。為了研究C4H基因的表達是否受這些因素的調節，本實驗采用熒光定量PCR的方法對C4H在不同處理下不同時間點的表達量進行了分析。本研究采用qRT-PCR分別檢測未處理組對照組、機械傷害及100 μmol·L-1 MeJA分別處理（2，4，8，12，16，20，24 h）後C4H基因的表達情況，結果顯示C4H基因在新鮮愈傷組織中表達量較低，在MeJA處理下，C4H基因的表達緩慢升高，20 h時達到最高表達水平，而後緩慢下降，但仍然高於健康中的表達水平；機械傷害對C4H基因的誘導強度明顯強於MeJA處理，表達在8 h時到最大，然後急劇下降。
C4H序列來自GenBank數據庫；數字為自舉檢驗置信值（1 000個重複）。
4 討論
肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）是植物苯丙烷代謝通路中的第2個酶，該酶在植物細胞中的含量可以影響黃酮、木質素及芳香族類物質的合成等多條代謝支路[16]。逆境脅迫下，植物可通過調節一係列合成相關酶基因的轉錄水平從而影響其黃酮類和芳香族類的合成和積累[13]，其中就包括C4H。Ryan等[7]在矮牽牛花中的研究發現，UV-B脅迫處理下，C4H 等基因表達量的增加使得植物組織中總黃酮含量增加。Baek等[17]在黑莓中發現，黃酮積累量與C4H表達量在果實發育的不同時期表現了同步增加或減少的變化趨勢。Liu等[18]發現K離子缺乏誘導的菊花中C4H等基因的表達量減少，造成了該部位黃酮含量的降低。植物中有多個參與苯丙烷類代謝途徑的P450酶類，其中C4H作為苯丙烷類代謝途徑的第1個P450，其一級結構中與肉桂酸結合的特異氨基酸殘基以及高級結構（二級結構和三級結構）所形成的活性中心口袋[19]，使其在結構和功能上與其他P450區別開來[13]。此外，植物黃酮的生物合成一般定位於內質網外膜上，由一係列特定的黃酮合成相關酶組成的多酶複合體連續合成並轉運到特定的亞細胞結構中[20]。C4H的N-末端的膜錨定信號基（signal-anchor sequence），使其定位於內質網外膜上，參與苯丙烷類代謝途徑中多酶複合體的亞細胞定位和內質網上電子鏈的化學傳遞[21]。
芳香族化合物是沉香藥材的重要有效成分之一[22-23]，解析其生物合成途徑是闡明結香機製和建立高效結香技術體係的分子基礎。高通量測序技術是非模式藥用植物基因挖掘的有效手段，課題組前期對白木香進行了轉錄組分析，從中得到大量關鍵合成酶基因片段[3，9]。本研究根據測序得到的C4H基因的轉錄本信息，成功從白木香中克隆了一個C4H基因的全長cDNA並對其進行生物信息學分析。結果表明，C4H和其他植物中已經鑒定的C4H具有較高的同源性及相類似的理化特性， 說明本研究克隆的C4H屬於C4H基因家族。健康的白木香不能產生沉香， 隻有受到傷害後才能被誘導產生，用典型的機械傷害及MeJA處理2種方法處理健康的愈傷組織，檢測C4H基因的表達，發現C4H 基因顯著受這2種傷害的誘導，該結果初步揭示了C4H基因在沉香形成中的可能作用。
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