白木香肉桂酸—4—羥基化酶（C4H）基因的克隆及表達分析
資源與鑒定
作者：梁良 韓曉敏 張爭 郭慶梅 徐豔紅 劉娟 廖永翠
[收稿日期] 2013-10-28
[基金項目] 國家自然科學基金項目（31000136， 81173481）；北京市自然科學基金項目（6102024）；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目（2008）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（20091106120009）；國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAI01B07）；海南省中藥現代化專項項目（2010ZY001， 2012ZY002）；海南省重大科技研發專項（ZDZX20100006）
[通信作者] *張爭，Tel：（010）57833363， E-mail；*郭慶梅，教授，博士生導師，Tel：18615187362，E-mail
[作者簡介] 梁良，Tel：（010）57833363，E-mail
[摘要] 對國產沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis肉桂酸-4-羥基化酶基因C4H編碼區進行克隆，並對其進行生物信息學分析和表達分析。根據已報道的白木香傷害轉錄組高通量測序結果分析獲得1條具有肉桂酸羥化酶酶保守結構域的C4H基因序列，采用RT-PCR技術克隆得到白木香C4H基因編碼區序列，並對C4H蛋白進行生物信息學分析。另外，采用qRT-PCR方法對C4H基因在傷害脅迫下的表達模式進行分析。序列分析表明，所克隆的C4H基因編碼區開放閱讀框（opening reading frame，ORF）長為1 515 bp，編碼514個氨基酸，GenBank登錄號為KF134783。qRT-PCR實驗證明C4H基因受不同傷害處理的誘導，分別在8，20 h達到最高表達水平。白木香C4H基因的編碼區序列的分離克隆為進一步研究C4H蛋白在白木香中黃酮及芳香族類化合物合成途徑中的功能及表達調控奠定基礎。
[關鍵詞] C4H酶； 白木香； 芳香族化合物； 傷害
國產沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（ Lour. ） Gilg 含樹脂的木材。作為我國傳統中藥，沉香有具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，用於胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急[1]。沉香隻有在健康白木香樹受到外界傷害後才能形成[2]。但是，傷害誘導沉香形成的分子機製一直未得到清晰揭示， 製約了高效結香技術的建立。沉香的化學成分主要為：倍半萜類、芳香族類成分和2-（2-苯乙基）色酮[3-4]。合成芳香族化合物的苯丙烷途徑的關鍵酶之一是肉桂酸-4-羥基化酶 [5]。研究表明，C4H在轉錄水平上的豐度和蛋白質水平上的活性能有效影響植物中芳香族化合物和黃酮類化合物的生物合成量[6-8]。本實驗根據已知的植物C4H的氨基酸序列進行同源序列比對，設計引物，應用RT-PCR從白木香中克隆C4H基因全長並進行序列分析，了解白木香C4H基因的結構與功能，這對從分子水平上探討白木香苯丙烷類次生代謝途徑具有重要意義。
1 材料
中國醫學科學院藥用植物研究所溫室栽培的3年生白木香莖誘導產生的愈傷分別進行機械傷害（用滅菌後的刀片切割至體積約為5 mm3的小塊）和100 μmol·L-1 MeJA（茉莉酸甲酯）處理，於處理後2，4，8，12，16，20，24 h取樣，用於提取總RNA，檢測C4H基因在健康和傷害後愈傷組織中的表達差異。
2 方法
2.1 總RNA提取
按照EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（Aidlab，中國）實驗操作步驟進行RNA製備，製備好的總RNA最終溶解於30 μL RNase free水中， 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，分光光度計NanoDrop 2000C （Thermo Scientific， 美國） 測定RNA濃度。
2.2 cDNA第一鏈的合成
利用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 試劑盒將白木香總RNA反轉錄為第一鏈互補鏈DNA （ cDNA）。反轉錄的反應條件及程序均按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書進行。
2.3 C4H基因的克隆
從白木香轉錄組高通量測序[9]結果中獲得1個由表達序列標簽拚接而成的序列，經注釋分析發現此片段是具有完整開放閱讀框的C4H基因，其開放閱讀框為1 515 bp，定名為C4H。
根據GenBank中報道的植物C4H基因同源性較高的核苷酸序列，設計保守區簡並引物C4H-F：CTTCTTCCCGACACAAAATATCT 和C4H-R：CCCAAAACAGTACATTGGACAG。以白木香總RNA的反轉錄產物為模板，按照下列體係進行擴增：cDNA 3 μL，10×Pfu buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol·L-1） 4 μL，Taq Plus（2.5 U·μL-1） 1 μL，10 μmol 引物各1 μL，終體積為50 μL。反應程序95 ℃ 5 min；70 ℃ 60 s；48 ℃ 60 s；72 ℃ 2 min；30個循環；循環結束後72 ℃延伸反應5 min；4 ℃保存。經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測後，將回收的目的片段回收與pGM-T載體連接，經熱激法轉化到大腸杆菌TOP 10中，用藍白斑篩選重組子，挑選陽性克隆的單菌落37 ℃培養12～16 h，經菌液驗證後選擇擴增出與目的片段一致的條帶的克隆（2個）送上海英濰捷基生物技術公司（北京測序部）進行測序。
2.4 C4H的生物信息學分析
2.4.1 C4H蛋白的理化特性分析 基因編碼蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server 提供的在線工具Protparam[10]。
2.4.2 C4H跨膜區及三維結構預測 采用TMHMM 2.0進行跨膜結構域預測； 采用SWISS-MODEL進行蛋白質二級結構分析；采用Phyre進行結構域的三維建模[11-12]。
2.4.3 進化樹分析 將C4H翻譯的氨基酸序列與NCBI 數據庫中的C4H氨基酸序列在線BLAST比對， 通過MEGA4軟件構建Neighbor-joining係統進化樹。進化距離的計算采用泊鬆校正法，Bootstrap重複次數為1 000次[13]。
2.5 白木香C4H基因在不同傷害處理時間的表達分析
實時熒光定量PCR （real-time PCR） 為了明確C4H 基因在不同組織及不同傷害處理下的表達特性， 利用熒光定量PCR進行表達量的檢測。檢測白木香愈傷組織中C4H基因在其不同傷害處理及不同處理時間的表達情況。儀器采用伯樂的CFX96TM C1000 實時PCR檢測係統。反應體係為：2×SYBR Premix Ex TaqTM 5 Μl；正反向引物濃度均為0.25 μL； cDNA 模板0.3 μL； 加水補足至10 μL， 每個反應體係至少重複3次。實時PCR 擴增程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 20 s，40個循環。實時PCR反應均以三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內參[14-15]。