正文 第55章 任務8.1果樹、林木植物組織培養快繁(3 / 3)

胡楊的莖尖、腋芽、葉片等都可以作為外植體,以芽誘導叢生芽,分化時間短,繁殖速度快,是理想的外植體材料。選取直徑為3~4mm的當年生胡楊枝條,用自來水衝洗幹淨,在無菌條件下,用70%酒精消毒30s,然後用0.2%升汞溶液消毒6min,無菌水衝洗5~6次,用無菌吸水紙吸去材料表麵多餘的水分。

(2)帶芽莖段的接種與培養;

將幼枝切成長度為1cm左右的小段,切掉和消毒劑接觸的部分,然後接種到添加6BA0.5mg/L和NAA0.5mg/L的MS啟動培養基上。培養溫度25~27℃,每天光照10h。莖段外植體接種後1周左右,在切麵上即可見到形成層部位出現黃白色致密的愈傷組織。接種2~3周時,兩端切麵上的愈傷組織明顯增生凸出,莖上的皮孔已膨大,且從皮孔內分化出質地疏鬆的白色愈傷組織,在同一材料有的還可以從皮孔處長出小芽。隨著皮孔上愈傷組織的進一步增生,可以見到白色愈傷組織中間出現一些顆粒狀的綠色愈傷組織塊,乃至整個愈傷組織變為綠色的小絨球狀。綠色的愈傷組織進一步分化後,長出一叢葉子較為肥厚的微芽,以後逐漸發育成為叢生芽。莖段切口端的愈傷組織在材料接種後約一個半月亦可分化出小植株。

(3)葉片的接種與培養;

取試管苗中部和上部的葉片,切成小塊,接種在MS+6BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的誘導培養基上,培養溫度25℃左右,每天光照10h、光強800lx。5d後,切口處開始膨大,並逐漸形成愈傷組織,一個月後,將愈傷組織塊轉接到MS+6BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L的培養基上,誘導其產生叢生芽。

2)繼代培養;

為了促進叢生芽發育,可將其轉移到MS+6BA0.2mg/L+NAA0.2mg/L壯苗培養基上發育成無根健壯小苗。將在壯苗培養基上培養了3~4周的無根苗莖切割成0.5~1cm的切段,然後轉接到MS+6BA0.5~1mg/L+NAA0.5mg/L增殖培養基上,再進行培養,以誘導叢生芽分化。經過多次繼代培養後,可得到大量的試管苗。

3)試管苗的壯苗與生根培養;

將叢生芽轉接到6BA和NAA都是0.2mg/L的MS壯苗培養基中培養,當無根的試管苗長至2~3cm高時,即可在無菌條件下將其從基部切下,置於IBA40mg/L溶液中預處理1.5~2h,以後再轉接到無激素的MS+蔗糖30g/L的培養基上。經10d左右培養,莖基部切口附近即開始陸續長出不定根。再經10~15d培養,即可成為完整的小植株。

4)試管苗的馴化與移栽;

將生根試管苗瓶口打開煉苗3~5d後,移栽到河沙、壤土、草木灰(1∶1∶1)的混合基質中,注意加蓋塑料薄膜保溫保濕,10d後可以揭去薄膜,成活率可達90%以上。

5)影響胡楊植株再生的因素;

(1)外植體;

從植株中部和上部取材的葉片再生不定芽能力要比下部強。從生理狀態看,從室外采集的材料作為外植體,誘導愈傷組織時間長,不能再生芽;而用無菌苗莖段、葉片作為外植體,誘導時間短,並可產生大量叢生芽。選擇冬芽作為外植體的試管苗,增殖率隨繼代次數的增加而增加;而以嫩枝段為外植體的增殖係數在2~3。以冬芽為外植體的試管苗,繼代增殖方式是形成叢生芽;而以嫩枝段為外植體的試管苗,在繼代培養中隻做伸長生長,並不形成叢生芽。

(2)基本培養基;

用於胡楊組織培養的基本培養基有MS、WPM、改良的H培養基等,但用於芽誘導的基本培養基以MS較好。

(3)生長調節物質;

細胞分裂素在芽誘導中發揮重要作用,其中ZT要比6BA、KT效果好。生長素往往和細胞分裂素配合使用,能較好地誘導芽的分化,常用的生長素為NAA。在芽誘導培養時,當NAA濃度高於0.1mg/L時,莖段就會產生大量愈傷組織,明顯抑製不定芽的形成。在生根培養時,一般不加細胞分裂素,僅加入IBA或NAA。

(4)糖類和添加劑;

果糖和葡萄糖比蔗糖更有利於胡楊芽的生長,使用濃度一般在2%~3%。濃度太高易使愈傷組織變黑老化,不利於分化。氨基酸有助於提高胡楊芽叢增殖的能力,而添加活性炭後芽叢不增殖,甚至發黃,可能是活性炭吸附了某些鹽分,造成芽苗的生理失調。

8.1.5櫻花快繁;

櫻花,別名山櫻花,為薔薇科薔薇屬落葉喬木,原產我國長江流域、日本和朝鮮等地。櫻花的花朵極其美麗,有白色或淺紅色,少數為黃色。每年4—5月盛開,滿樹爛漫,嫵媚多姿,輕盈嬌研,花豔奪目,是早春開花的著名觀賞花木。可孤植也可成片栽植,還可盆栽作樁景,造型典雅可愛。櫻花以嫁接為主,也可扡插、分株,但扡插生長速度慢,利用組織培養可大大提高櫻花的繁殖速度。

1)初代培養;

(1)外植體的選擇與消毒;

櫻花的莖尖、腋芽和葉片都可以作為外植體。在4月下旬至5月初,選擇生長健壯、無病蟲害的新生櫻花嫩枝作為外植體,剪去葉片,保留0.5cm的葉柄,在自來水下衝洗幹淨,並用洗潔精水清洗一遍。將枝條剪成6~8cm長的莖段,在無菌條件下,用0.1%升汞溶液處理10min,還可加入幾滴Tween80配合使用,再用無菌水衝洗5~6遍,無菌吸水紙吸去材料表麵多餘的水分。

(2)外植體的接種與培養;

將外植體剪切成單芽莖段,接種到MS+6BA2~3mg/L+IAA0.5mg/L芽誘導培養基上培養。培養溫度25℃左右,光照強度1000~1500lx,每天光照12h。12d後,莖段切麵處產生愈傷組織,腋芽突起,開始萌動、生長,一般可長出l~3個芽。

2)繼代培養;

將誘導出的芽切下,轉入MS+6BA0.5~3mg/L+NAA0.1~0.3mg/L繼代培養基中進行增殖培養,1個月繼代1次,增殖係數一般可達3~5。在叢芽增殖培養基中加入低濃度的GA3(0.3mg/L),還可以提高叢生芽的增殖率。在繼代培養中,培養物裏的6BA存在一定的累積效應,即發生“馴化”現象。因此,隨繼代次數的增加,應逐漸減少培養基中的6BA用量。

3)試管苗的壯苗與生根培養;

當芽苗增殖到一定的數量後,就可以進行壯苗生根培養。對生長細弱的小苗先轉入MS+6BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L培養基中進行壯苗培養,當小苗長到3cm左右比較健壯時,轉入1/2MS+NAA1mg/L+IBA0.2mg/L生根培養基上進行生根培養。一些健壯的小苗,可以直接轉入生根培養基中進行生根培養。培養溫度以25~27℃為好,光照強度可增加到2000~2500lx,光周期不變。無根苗轉入生根培養基後,一般在1周後開始生根。

4)試管苗的馴化移栽;

將生長健壯的生根試管苗移至煉苗室,避免陽光直射,打開瓶蓋煉苗5d,使瓶內外的濕度比較接近。移栽前,往瓶內倒入少量25℃左右自來水,並輕輕搖動,使根係與培養基分離,然後小心地從瓶內取出試管苗,放在溫水盆裏洗淨根部的培養基,在800倍的多菌靈溶液中浸泡4min,移栽到珍珠岩∶腐殖土∶河沙(1∶2∶2)的混合基質中,澆足水後,及時蓋上塑料薄膜保濕,蓋上遮陽網遮陰1周,逐漸增加光照強度並通風。1~2周後,幼苗長出新根,此時揭去薄膜。待有新葉長出時,可完全撤去遮陽網。當小苗高達15cm左右,根係發達時即可進行大田定植。

5)影響櫻花培養的因素;

(1)取材的時間;

黃守印等(2001)在對比5月初和10月初取得的材料培養時發現,5月取得的材料培養生長分化正常,而10月取回的材料培養後,新長的葉片容易脫落,在葉柄基部產生愈傷組織,但不能形成叢生苗。

(2)褐變;

引起櫻花褐變的因素主要有材料的年齡、外植體損傷、培養時間等。一般幼齡材料具有較強分生能力,生長旺盛,可大大減輕褐變。消毒劑容易對材料造成傷害,應選擇合適的消毒劑和消毒時間,最好不用酒精。在接種時,盡可能快地剪切莖段,以免夾傷切口處的組織,並快速接種,減少切口在空氣中暴露時間。長時間培養也易引起褐變,當誘導出芽後應盡快轉接。此外,在培養基中添加抗氧化劑(如抗壞血酸50~100mg/L,間苯三酚等)或0.1%~0.5%的活性炭,也能減緩褐化程度。