【學習目標】
了解常見果樹、林木、經濟作物、花卉的組織培養和脫毒技術。
【能力目標】
能根據資料，以及前麵所學知識，獨立設計植物組織培養脫毒與快繁的技術路線，並能加以實施。植物組織培養快繁技術應用案；
8.1.1櫻桃脫毒與快繁；
櫻桃有中國櫻桃、歐洲櫻桃，屬薔薇科桃李亞科桃李屬櫻桃亞屬。櫻桃作為“春果第一枝”的水果，鮮豔美麗，小巧玲瓏，備受人們歡迎。果實營養成分豐富，可鮮食，也可加工成罐頭、果脯、蜜餞等。櫻桃樹姿阿娜多姿，異常優美，葉色亮綠。盛果時，樹體紅綠相間富有詩意，是綠化、美化環境的理想樹種，因此，近年來我國櫻桃栽培麵積呈上升趨勢。應用植物組織培養技術，可進行脫毒培養，加快優良品種的推廣，提高產量和質量。
1）脫毒；
（1）病毒種類；
危害櫻桃的主要病毒有櫻桃壞死鏽斑病毒（CNRMV）、櫻桃壞死環斑病毒等，病毒的侵染常常導致櫻桃產量和果實品質的下降。
①外植體的消毒。取櫻桃品種一年到兩年生的休眠枝條，放入培養箱，經水培後取其萌發的嫩芽。先將外植體用洗滌劑水浸3min後，流水衝洗60～90min，然後用70%酒精浸泡30s，無菌水衝洗1次後，用0.1%升汞（HgCl2）滅菌，一般滅菌5～8min後，用無菌水衝洗4～5次，置於無菌濾紙上，吸幹水分備用。
②莖尖剝離。滅菌後剝取生長點，用鑷子固定材料，用解剖針在解剖鏡下剝除芽外部鱗片、幼葉和較大的葉原基，使生長點露出，然後切下生長點（含2～3個葉原基），材料大小小於0.5mm作為培養材料，接種於初代培養基上。初代培養基為MS+6BA1mg/L+NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，調節pH至5.8，培養溫度25℃，光照強度2000lx～3000lx，每天光照14h。誘導生長點伸長生長。
③試管苗的增殖培養。將叢生芽或帶1～2個芽的莖端轉入增殖培養基上增殖，增殖培養基為MS+6BA0.5～1mg/L+NAA0.05～0.3mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L，培養40d後，誘導形成叢生芽。
④試管苗的生根培養。叢生芽在增殖培養基上生長到7周後，取苗高2cm以上的新梢轉移到生根培養基上進行誘導生根。生根培養基為1/2MS+IBA0.2～1.4mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L，培養20d後，統計芽苗生根率。
⑤脫毒苗的檢測；
A.櫻桃壞死鏽斑病毒。新西蘭用紫櫻桃作為檢測CNRMV的指示植物，用雙重芽接法接種，當有病毒時，指示植物紫櫻桃葉片上出現紫褐色斑點，逐漸擴大至0.5～1cm不規則紫褐色斑塊。有些葉片其葉肉組織壞死，葉片卷曲，較早落葉。
檢測時間需幾周至幾年，發病溫度為10～27.8℃，最適溫度為20～24℃，較高氣溫下，感病株新梢和短枝多枯死。
b.櫻桃壞死環斑病毒。芽接到白普賢櫻花（Shirofugen）上，4周後芽接周圍即局部壞死。病部木質部先變黑色，並溢出大量膠質。用黃瓜作指示植物，病毒症狀為葉片出現褪綠環斑，生長點壞死。
2）快繁；
以脫毒培養後，試管苗中要檢測的病毒為陰性，即可直接用於繼代培養擴大繁殖。也可以使用健康植株上莖尖培養進行快繁。
（1）初代培養；
用MS作為基本培養基，隨6BA濃度增加，試管苗分化的新增芽數也隨之增加，當6BA濃度0.5～0.8mg/L時，苗分化芽數較少，但苗健壯，莖較粗，葉片大而厚，有效芽數較多；當6BA濃度達1～2mg/L時，新增芽數較多，但苗相對細弱，葉片小，節間長，往往製約新梢的生長及伸長，有效芽數反而降低。附加IAA0.1～0.2mg/L，有利於新梢的伸長生長，有效芽數略有增加。因此，在櫻桃微繁的初期，用較高濃度的6BA有利於試管苗的增殖。
（2）繼代培養；
在繼代繁殖的後期，即轉接生根培養基之前，較低的BA濃度有利於出壯苗。如果此時轉用F14培養基，並同時降低BA濃度，則苗更加粗壯，葉色濃綠，大大提高轉接生根苗的比例，此時附加IAA0.1～0.2mg/L及GA30.5mg/L效果更好。另外，ZT、KT等細胞分裂素，促進分化的作用不如6BA顯著，且價格較貴，因此，在商業化生產中以6BA為好。
（3）生根培養；
用1/2MS或1/2F14，附加IBA0.5～0.8mg/L或NAA0.5mg/L，蔗糖20g/L的生根培養基，根的生長速度雖慢，但生長整齊，粗壯，有利於移栽，當根數平均為7.4條，長度達0.5～1cm，移栽成活率可達95.7%。
（4）試管苗的移栽；
移栽前，打開瓶塞鍛煉3～5d。移栽基質可選用粗沙、蛭石（蛭石∶草炭∶粗沙為1∶1∶1）及粗河沙。栽培方式采用育苗袋，育苗箱及沙床，於3—4月移栽至溫室沙床。
（5）移栽條件；
在溫度為20～28℃、空氣濕度90%～95%時最好，在25℃下移栽的試管苗，鮮重最重；在28℃下移栽的試管苗生根最好，新增芽數最多。
8.1.2蘋果的脫毒與快繁；
蘋果屬於薔薇科蘋果屬，全世界約有35種，原產我國的有23種，是落葉果樹的主栽品種。蘋果育苗的傳統方法是將栽培品種嫁接在實生砧木上，20世紀70年代以來，蘋果組織培養技術日趨成熟，在脫毒苗生產、矮化砧的快速繁殖方麵得到了廣泛的應用。
1）脫毒；
（1）病毒種類；
目前世界上發現蘋果病毒病有30多種，在我國發生危害的主要有6種，即蘋果鏽果病毒、蘋果綠皺果病毒、蘋果花葉病毒、蘋果褪綠葉斑鏽果病毒、蘋果莖痘病毒、蘋果莖溝槽病毒。前3種為非潛隱性病毒病，有明顯的症狀，肉眼可見，後3種是潛隱性病毒病，在我國主要產區分布廣泛。潛隱性病毒的帶毒率高達40%～100%，且多為病毒複合感染，導致生長勢減弱、產量下降等。
（2）熱處理脫毒；
選取2～3cm高的試管苗，置於人工氣候箱高溫環境中處理。為提高試管苗的耐熱性，先在（32±1.5）℃的溫度下預處理1周。處理時間和處理溫度的最佳組合為白天溫度（37±1.5）℃、晚上溫度（32±1.5）℃，熱處理35d，變溫處理脫除褪綠葉斑病毒和莖溝病毒效果好，存活率最高，可獲得最多的無潛隱病毒試管苗。
（3）熱處理結合莖尖培養脫毒；
將休眠植株於溫室內20～25℃條件下誘導萌發，長到5～6片葉時，在32～35℃溫度下預處理1周。然後在（38±0.3）℃、相對濕度80%的條件下處理25～35d，得到長5～10cm健壯的新生嫩枝。將嫩枝切成1cm左右的莖段，用70%酒精和0.1%升汞消毒，最後用含VC0.5%和檸檬酸0.3%的無菌水衝洗3次。無菌條件下切取2mm莖尖接種到MS+6BA2mg/L誘導培養基上進行培養。培養條件為溫度25℃、光照強度1000～1500lx、光照時間為12～16h。該法可全部脫去ACLSV和ASGV等潛隱性病毒，比隻用熱處理脫毒效果好得多。
（4）微體嫁接繁殖脫毒；
采用莖尖微體嫁接脫毒，以當地優良砧木的種子作砧木。種子經低溫層積處理後再消毒，去皮後將胚接種到含有MS無機鹽和0.8%瓊脂的培養基上。在25℃黑暗中培養15d，切去胚軸和子葉。去頂幼苗移至裝有液體培養基（含有MS無機鹽和7%的蔗糖）的平底試管中，內有一濾紙橋，中有小孔，砧木幼苗穿過小孔使其固定。接穗可用試管培養的新梢，或從田間取芽，在超淨工作台上剝離莖尖材料，以液體培養基濕潤接穗，然後與砧木胚軸維管束部連接，1周後接穗與砧木互相結合。6周後在接穗產生4～6片葉時，就可往外移栽。
微體嫁接時接穗莖尖大小宜為0.2～0.3mm，帶有2～3個葉原基較好，既可以除去病毒，又有較高的成活率。
（5）蘋果病毒檢測；
①指示植物法。對非潛隱性病毒，通過對病害的表現症狀即可鑒別；對潛隱性病毒，大多采用指示植物法。該方法比較可靠，操作簡單，但一般需要時間較長（2～3年），如用溫室鑒定10周內可完成。
②ELISA。把抗原與抗體的免疫反應和酶的高效催化作用結合起來，形成一種酶標記的免疫複合物，結合在該複合物上的酶遇到相應的底物時，催化無色的底物產生水解，形成有色的產物，從而判斷被檢測材料是否有病毒。該法操作簡便、快速。