二級種子罐培養，溫度31～33℃，pH7.2，殘糖量≤0.8mg/mL。兩步發酵收率78.5％。
（3）2酮L古龍酸的分離與純化
①一次交換。鹽酸酸化，調菌體蛋白等電點，沉降4h以上。上清液以2～3m3/h的流速壓入陽離子交換柱，當流出液pH為3.5時，收集交換液。交換完後用純水衝柱。
②加熱過濾。合並流出液和洗液，調節pH至蛋白等電點，加熱到70℃，並加0.3％的活性炭後升溫至90～95℃，保溫10～15min使蛋白凝結。停止攪拌，快速冷卻後高速離心。
③二次交換。將上步上清液加入二次交換柱，洗脫，至流出液pH1.5時，收集交換液，控製pH為1.5～1.7，交換完畢後，純水洗柱。
④減壓濃縮。二次交換液先進行一級濃縮，控製真空度、溫度，至濃縮液相對密度達1.2，出料。同樣條件下再進行二次濃縮，盡量濃縮幹。加少量乙醇，冷卻結晶。甩濾，冰乙醇洗滌，得2酮L古龍酸（m.p.158～162℃），收率80％。
（4）粗維生素C的製備
目前轉化的方法主要有酸轉化和堿轉化兩種方法。
①酸轉化法。傳統的酸轉化法是采用濃HCl將古龍酸直接轉化為VC，但酸轉化對設備的腐蝕嚴重，汙染環境，影響產品質量，現已逐漸被堿轉化法所取代。
②堿轉化法。堿轉化法是先將古龍酸與甲醇在濃硫酸催化作用下生成古龍酸甲酯，再使用NaHCO3進行堿轉化，使古龍酸甲酯轉化為VCNa。采用此法可避免酸轉化的缺點，且操作簡單，適用於VC的規模化生產，但是堿轉化存在著反應周期較長，甲醇單耗高。
（三）二步發酵法維生素C發酵工藝控製
1）pH值及溫度的控製
一次發酵過程中，生黑醋杆菌發酵初始pH為5.1～5.3，發酵溫度控製在34±1℃，通風比要求1vvm以上，該發酵過程中耗氧量大，發酵4h後溶解氧濃度急劇下降，直至10h左右才逐漸升高，當溶解氧濃度升到最高點時，表明反應已經接近終點。若是弱氧化醋杆菌發酵pH為6.2～6.8，溫度28～30℃，通風比0.6～1vvm，可采用氣生式發酵罐進行，發酵結束後山梨糖得率可達96.5％以上。該發酵收山梨醇底物濃度影響非常大，因此要獲得高濃度山梨糖，必須采用流加方式進行，這樣可為第二次發酵奠定良好基礎。
第一次發酵結束後，發酵醪溫度升至80℃保溫10min，完成殺菌後，補充所需的原輔料，調節pH到6.8左右，控製發酵溫度30℃進行共生發酵。當芽孢菌產生芽孢時，氧化葡萄糖酸杆菌開始產生2酮基L古龍酸，知道完全形成芽孢出現遊離芽孢時，酸的產生也達到高峰。發酵過程要注意保持pH6.8左右，經過20～36h發酵後，待山梨糖基本耗盡，菌體逐漸自溶時，發酵達到終點。由於山梨糖的初始濃度對產物的生成影響大，因此發酵可采用流加發酵的方式。
2）葡萄糖酸杆菌數量的控製
第二步發酵期間，要保持葡萄糖酸杆菌數量的一定，小菌將L山梨醇轉化為2KLG，而大菌本身不產酸，是搭配菌，其作用僅是通過刺激小菌的生長而促進小菌產酸。
3）溶解氧濃度的控製
產酸前期應處於高濃度氧濃度；產酸中期，溶氧濃度控製在3.6～6.0mg/mL；產酸後期，耗氧量減少。
（四）維生素C的精製
①維生素是一類對生物生長發育起調節作用的、化學結構不同的、小分子有機化合物。微生物發酵技術提供了一種可替代化學合成的更廣泛生產維生素的有效方法。
②維生素C（VtaminC）又稱L抗壞血酸（LAscorbicacid），是無色無味的單斜晶狀結晶體。目前維生素C的生產主要有萊氏法和二步發酵法，我國的維生素C生產企業一般采用二步發酵法。二步發酵法生產維生素C可以分為發酵、提取和轉化3大步驟，即D山梨醇先經醋酸杆菌氧化為L山梨糖，再通過小菌大菌的混合發酵生成維生素C前體2酮L古龍酸，最後用化學法將2酮L古龍酸轉化為維生素C。二步發酵法的工藝控製通過調節pH值、溫度、葡萄糖酸杆菌數量、溶解氧濃度來完成。粗維生素C經過脫色結晶等工藝，便可製得成品。
③本項目簡要概述了維生素發酵生產的行業現狀。並以我國二步法維生素C的發酵生產工藝為例，詳細介紹了二步法發酵維生素C的生產菌種、發酵原理、發酵工藝流程、發酵工藝控製及維生素C的精製工藝。
1.簡述萊氏法的優點與缺點。
2.在轉化工藝上，除了堿轉化外，還有哪些轉化方法，不同轉化方法各有何特點？