20世紀70年代初，中國科學院微生物研究所和北京製藥廠合作，研製成功了“二步發酵法”製備VC的新工藝。二步發酵法的第二步發酵由氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteriumoxydans，俗稱小菌）和巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium，俗稱大菌）等伴生菌混合發酵完成，其中小菌為產酸菌，但單獨培養生長緩慢，傳代困難，且產酸能力很弱；大菌單獨培養容易，但不產生2酮基L古龍酸（2ketoLgulonicacid，2KGA），與小菌混合培養時不僅可以促進小菌生長，而且能大大增強小菌的產酸能力。有研究指出，大菌為小菌提供某種生長因子促進其生長，並且能夠提供某些生物活性物質協助小菌合成2KGA，二菌混合培養呈互生關係。
維生素C“二步發酵法”已在中國、歐洲、日本和美國申請專利，並於1986年對瑞士的HoffmannLaRoche公司進行技術轉讓，成為新中國成立以來的最大一項醫藥技術出口項目。“二步發酵法”的工藝路線與“萊氏法”不同之處在於其采用混合菌發酵法代替化學法轉化L山梨糖合成2酮基L古龍酸。簡化了生產工藝，降低了生產成本，減少了“三廢”汙染，多年以來一直被國內廠家使用。目前，國內4大維生素C生產企業——東北製藥總廠、華北製藥集團維爾康製藥有限公司、石家莊製藥集團維生藥業有限公司和江蘇江山製藥有限公司都采用該法生產維生素C。在幾十年的工藝發展中，二步發酵法工藝不斷地得到了改進。
目前專家正在研製葡萄糖“一步發酵法”生產維生素C的新工藝，但由於其在生產上還存在諸多問題，如中間產物2，5DKG對熱不穩定，生產周期較長，生產效率低，成本高等，因此應用於工業生產實踐還具有一定距離。如果研究成功，生產成本肯定會大大下降，到那時兩步發酵法就沒有優勢了。
本項目以二步法發酵生產工藝為實例，詳細介紹維生素C二步法的生產發酵工藝。
（二）二步法維生素C發酵工藝流程
二步發酵法生產維生素C可以分為發酵、提取和轉化3大步驟，即D山梨醇先經細菌氧化為L山梨糖，再通過細菌發酵生成維生素C前體2酮L古龍酸，最後用化學法將2酮L古龍酸轉化為維生素C。
1）維生素生產菌種
近年來，在改進生產工藝同時，維生素C二步發酵法中優良新菌種選育及發酵條件調控的研究成為熱點之一。在二步發酵法生產維生素C過程中，優良菌株、適宜培養基及發酵條件對提高生產效率具有重要意義。因此目前很多學者已把目光投向新菌種選育或菌種改良、發酵條件調控等方麵，以提高發酵過程中維生素C生產前體2酮基L古龍酸的產量。
維生素C二步發酵法中第一步D山梨醇轉化為L山梨糖是由醋酸杆菌（Acetobacterspp.）完成的，該工藝在萊氏法中就已使用，由於工藝成熟且生物轉化率高（98％以上），因此在二步發酵法中得以延用。第二步是混合菌發酵，由產酸菌和伴生菌以一定比例搭配，混合培養後進行發酵合成2KGA。對於混合發酵菌株的組合，維生素C工業生產常用產酸菌（俗稱小菌）為氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans），伴生菌（俗稱大菌）為巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、蠟狀芽孢杆菌（Bacilluscerues）或蘇雲金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）。
2）二步發酵法工藝流程
在氫氣、黑曲酸菌的作用下通過一步和二步發酵得到古龍酸鈉發酵液。
（1）D山梨醇的合成
50％葡萄糖溶液在75℃下加入活性炭，用石灰乳調節至pH8.4，加入鎳做催化劑，通氫氣，壓力3.43MPa，反應溫度140℃。反應結束後，靜置沉降除去催化劑，反應液經離子交換樹脂和活性炭處理後，減壓濃縮，得到含量60％～70％的D山梨醇，無色透明或微黃透明黏稠液體，收率約為97％。
（2）2酮L古龍酸的微生物發酵
①菌種處理。將菌種活化、分離、混合培養。將活化培養的菌種移入三角瓶液體培養基培養，29～33℃振蕩培養24h，產酸量為6～9mg/mL，pH降至7以下，鏡檢正常無雜菌。
②發酵。第一步發酵：黑醋酸杆菌（從D山梨醇到L山梨醇）。
一級種子罐加料，控製溫度29～30℃，壓強0.05MPa，pH6.7～7.0。
第二步發酵：葡萄糖杆菌和巨大芽孢杆菌混合培養。