5）脫色
脫色是用活性炭或脫色樹脂除去有色的物質，常用的是活性炭脫色。在所得清液中，加入活性炭（一般用量為檸檬酸量1％～3％，視酸解液的顏色而定）脫色，在85℃左右保溫30min，即可過濾。濾瓶用85℃以上熱水洗滌，洗至殘酸低於0.3％～0.5％即可結束，洗水單獨儲放，作為下次酸解時的底水使用。
6）樹脂吸附
離子交換樹脂是用來去除檸檬酸液中的各種雜質離子的。通過陽離子交換柱可去除Ca2+，Fe2+等陽離子。最常用的陽離子交換樹脂是732樹脂。檸檬酸進入陽離子交換柱後，要控製一定流速並用黃血鹽和酒精實時監測流出液中有無Ca2+，Fe2+，若有Ca2+，Fe2+應該立即停止進料。檸檬酸液中的陰離子可用陰離子交換樹脂去除，用AgNO3試劑監測流出液中的Cl-作為陰離子交換柱進料的控製終點。
7）濃縮與結晶
將脫色後過濾所得清液，用減壓法濃縮（要求真空度在600～740mm汞柱，溫度為50～60℃）。檸檬酸液濃縮後，腐蝕性較大，因此多采用搪瓷襯裏的濃縮鍋，濃縮液的濃度要適當，如濃度過高，會形成粉末狀；但濃度過低，也會造成晶核少，成品顆粒大，數量少，母液中殘留大量未析出的檸檬酸，影響產量。當濃縮達到36.7～37°Bé時即可出罐。檸檬酸結晶後，用離心機將母液脫淨，然後用冷水洗滌晶體，最後用幹燥箱除去晶體表麵的水。
母液可以再直接進行一次結晶，剩下的母液往往因含大量雜質，不宜作第三次結晶，但可以在酸解液中套用，或用碳酸鈣重新中和。幹燥箱的溫度要控製在35℃以下，如氣溫高於20℃時，可采用常溫氣流幹燥。
項目實訓：檸檬酸搖瓶發酵
1）實驗目的
①了解檸檬酸發酵原理及過程，掌握檸檬酸液體發酵及中間分析方法。
②了解黑曲黴培養過程中培養基基質濃度的變化與產物的生成規律。
2）實驗原理
黑曲黴發酵法生產檸檬酸的代謝途徑被認為是：黑曲黴生長繁殖時產生的澱粉酶、糖化酶首先將薯幹粉或玉米粉中的澱粉轉變為葡萄糖；葡萄糖經過酵解途徑（EMP）和HMP途徑轉變為丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，繼而經乙酰磷酸形成乙酰輔酶A，然後在檸檬合成酶的作用下生成檸檬酸。黑曲黴在限製氮源和錳等金屬離子條件下，同時在高濃度葡萄糖和充分供氧的條件下，TCA循環中的酮戊二酸脫氫酶受阻遏，TCA循環變成“馬蹄形”，代謝流彙集於檸檬處，使檸檬酸大量積累並排出菌體外。其理論反應式為：C6H12O6+1.5O2C6H8O7+2H2O。
3）實驗器材
（1）實驗材料
菌種：黑曲黴（本實驗室保存）。
黑曲黴種子培養基：20％玉米粉糖化液。
發酵培養基：20％玉米粉糖化全液與過濾後的玉米糖化清液1：5混合。
（2）儀器設備
搖床；離心機；超淨工作台；恒溫培養箱；滅菌鍋；析天平；蒸發器；pH計、分光光度計；比色管；容量瓶；濾布；布氏漏鬥；滴定管；水浴鍋；試管、燒杯、500mL三角瓶等若幹。
（3）藥品試劑
0.1429mol/LNaOH，1％酚酞試劑，碳酸鈣，95％乙醇，濃硫酸，3，5二硝基水楊酸試劑，葡萄糖；草酸銨結晶紫液（A液：1％結晶紫95％乙醇溶液。B液：1％草酸銨溶液。取A液20mL，B液80mL混合，靜置48h後使用）。
4）實驗步驟
（1）搖瓶種子製備
①搖瓶發酵培養基的配置。將玉米粉用100目篩子篩好備用，稱取200g玉米粉於燒杯中，同時加入自來水800mL，即質量比自來水：玉米粉為4：1，混勻。
②培養基的糖化。邊加熱邊攪拌培養基，待加熱到90℃後，加入高溫澱粉水解酶0.5～1mL，加熱攪拌恒溫保持20～30min，防止糊化粘壁，用碘指示劑檢驗不變藍，即糖化完全。得到20％玉米水解液全液（含碳6.73％，氮1.26％）。
注：篩玉米粉的目的是便於下次接種時菌種能以液體形式輕鬆吸出，用碘液檢驗澱粉含量時要待被檢測液冷卻後才能檢測，否則結果不準確。裝入搖瓶的培養基不能太多，否則培養過程中黑曲黴所需要的氧氣則不充分。
③分裝、滅菌。將糖化好的培養基裝入兩個錐形瓶中，裝入量為錐形瓶總體積的1/10，封口膜封口，121℃，滅菌15～20min。
④接種。待糖化好的培養基溫度降至40℃以下時，將活化的黑曲黴孢子接種入培養基中，在33～36℃，200～300r/min的搖床中20h左右，培養後菌體濃度應達60萬～150萬/mL，菌絲球為致密形的，菌球直徑不應超過0.1mm，菌絲短，且粗壯，分支少，瘤狀，部分膨脹為優。
（2）發酵培養
①發酵培養基的配置。將配置搖瓶發酵培養基時所剩的約700mL糖化培養基取出100mL，另外600mL用濾布（2～4層紗布）過濾，得到透明清液（含碳7.27％，氮0.13％），然後將未過濾的糖化培養基與500mL過濾後的清液混勻。
②分裝、滅菌。取40mL混合後的培養基加入500mL搖瓶（小於總體積的1/10），2層紗布封口，121.3℃，滅菌20min。
③接種。待培養基溫度降至40℃以下，接入發酵種子2mL，24h前於轉速100r/min，24h後於轉速200～300r/min搖床上，35℃連續培養72h。
（3）發酵過程檢測
①還原糖、檸檬酸的檢測。發酵0h，24h，48h，72h分別各取下兩瓶檢測還原糖（殘糖）、檸檬酸含量，以觀察發酵過程中黑曲黴的耗糖與檸檬酸的生成速率。
②pH值的檢測。每隔12h檢查pH值。
③黑曲黴菌絲形態的觀察。每隔12h鏡檢黑曲黴菌絲的形態變化。
5）檢測方法
（1）黑曲黴鏡檢
①直接取1滴發酵液於載玻片上，用蓋玻片密封後鏡檢。
②鏡檢過程：塗片→幹燥→固定→染色→水洗→幹燥→鏡檢（染料：草酸銨結晶紫液）。
（2）pH的測定
用pH計測得發酵液的pH。
（3）還原糖（殘糖）的測定
DNS還原糖測定法。
（4）檸檬酸的測定
檢測發酵過程中的總酸，精確吸取1mL的發酵液離心，上清液加入於100mL錐形瓶中，加入少量的去離子水，加2～3滴0.1％酚酞指示劑，用0.1429mol/LNaOH溶液滴定，滴定微紅色計算用去的NaOH毫升數，計為檸檬酸的百分含量。
6）實驗結果
（1）不同時間點菌絲形態和pH的變化
（2）還原糖（殘糖）與檸檬酸含量的測定
①有機酸發酵工業是生物工程領域中的一個重要並較成熟的分支。目前廣泛用於食品工業與化工原料的具代表性的有機酸主要有檸檬酸、乳酸、葡萄糖酸、蘋果酸、衣康酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸等。而發酵過程在這類酸的生產過程中起到了很重要的作用。
②檸檬酸又名枸櫞酸，化學名稱3羥基3羧基戊二酸，是三羧酸循環中的主要中間產物，是食品和飲料行業最廣泛使用的酸化劑。它在工業、醫藥等行業也有著廣泛的用途。
③黑曲黴是檸檬酸發酵工業中的主要菌種，檸檬酸發酵原料主要有糖質原料（甘蔗廢糖蜜、甜菜廢糖蜜）、澱粉質原料（主要是番薯、馬鈴薯、木薯等）和正烷烴類原料3大類。原料經過預處理後，便可進行接種與發酵。檸檬酸的發酵工藝控製主要通過黑曲黴檸檬酸發酵的代謝控製、溫度控製、pH值的控製、溶解氧的控製來完成的。發酵後的發酵醪在經過預處理、過濾、清液中和、酸解、脫色、樹脂吸附、濃縮與結晶便可完成檸檬酸的提取與精製。
④本項目以工業中檸檬酸的發酵生產的工藝為實例，結合工藝生產流程圖，全麵介紹了檸檬酸的發酵菌種、菌種的擴培與培養基的製備、黑曲黴發酵檸檬酸的基本原理、檸檬酸發酵工藝的主要流程、檸檬酸發酵工藝控製、檸檬酸提取純化的下遊工藝技術。
1.檸檬酸生產發酵菌種黑曲黴的特性是什麼？
2.簡述檸檬酸的生產工藝流程。
3.影響檸檬酸生產發酵的因素有哪些？如何控製？