生產上一般將發酵濾液酸化至pH等於2.0，加入1/3體積的乙酸丁酯（用量為濾液體積的1/3），混合後以臥式離心機（POD機）分離得一次BA萃取液，然後以NaHCO3在pH為6.8～7.4條件下將青黴素從BA中萃取到緩衝液中；再用10％H2SO4調節pH等於2.0，將青黴素從緩衝液中再次轉入到BA中（方法同前麵所述），得二次BA萃取液。在一次丁酯萃取時，由於濾液含有大量蛋白，通常加入0.05％～0.1％PPB防止蛋白乳化（在酸性條件下）而轉入BA中。
萃取條件：為減少青黴素降解，整個萃取過程應在低溫下進行（10℃以下），萃取罐用冷凍鹽水冷卻。
③脫色。在二次BA萃取液中加入活性炭150～300g/10億單位，進行脫色，除去色素、熱原，石棉過濾板過濾除去活性炭。
④結晶。萃取液一般通過結晶提純。不同產品結晶條件控製不同，現以青黴素鉀鹽為例說明。
a.醋酸鉀乙醇溶液飽和鹽析結晶。青黴素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，因此，在二次丁酯萃取液中加入醋酸鉀乙醇溶液，使青黴素遊離酸與高濃度醋酸鉀溶液反應生成青黴素鉀，然後溶解於過量的醋酸鉀乙醇溶液中呈濃縮液狀態存在於結晶液中，當醋酸鉀加到一定量時，近飽和狀態的醋酸鉀又起到鹽析作用，使青黴素鉀鹽結晶析出。
b.青黴素醋酸丁酯提取液減壓共沸結晶。與飽和鹽析結晶法一樣也是由青黴素遊離酸與醋酸鉀反應，生成青黴素鉀。所不同的是控製結晶前提取液的初始水分，使反應劑加入後，不能像飽和鹽析結晶那樣立即產生晶體，而是使反應生成的青黴素鉀先溶於反應液的水組分中，而後隨著減壓共沸蒸餾脫水的進行，使反應液中水分不斷降低，形成過飽和溶液，晶核產生並逐漸成長，在反應液中析出，得到青黴素鉀。
c.青黴素水溶液—丁醇減壓共沸結晶。將青黴素遊離酸的醋酸丁酯提取液用堿（KHCO3或KOH）水溶液抽提至水相中，形成青黴素鉀鹽水溶液，調節pH後加入丁醇進行減壓共沸蒸餾。蒸餾是利用丁醇水二組分能夠形成共沸物，使溶液沸點下降，且二組分在較寬的液相組成範圍內蒸餾溫度穩定等特點。進行減壓共沸蒸餾是為了進一步降低溶液沸點，減少對青黴素鉀鹽的破壞。在共沸蒸餾過程中以補加丁醇的方法將水分分離，使溶液逐步達到過飽和狀態而析出結晶。
項目實訓：10L青黴素的發酵實訓。
1）目的要求
①掌握產黃青黴菌株的擴大培養及液體發酵技術。
②提升小型發酵罐的空消、實消、接種、發酵監控等操作技能。
2）基本原理
以產黃青黴為生產菌進行發酵法生產青黴素。
3）儀器、試劑、實驗材料
①菌種：產黃青黴菌株（安瓿瓶冷凍孢子）。
②染液：乳酸石炭酸棉藍染色液。
③培養基：察氏瓊脂培養基、新鮮大米、種子培養基、發酵培養基。
④其他：小型二聯體發酵罐及發酵係統、小型凍幹機、生物傳感分析儀、可見光—分光光度計、小型離心機、試管、茄形瓶、顯微鏡、蓋玻片、載玻片、接種鉤、解剖針、濾紙20％甘油、玻璃紙、塗布棒、鑷子等。
4）方法步驟
（1）產黃青黴菌株（絲狀菌）的擴大培養、檢驗及保存
①斜麵培養基配製。配製察氏斜麵培養基1000mL，加熱溶解，分裝於試管中（分裝量為試管高度的1/5），121℃滅菌20min。滅菌後立即取出，冷至55～60℃時，擺置成適當斜麵（斜麵長度不超過試管總長度2/3），待其自然凝固。
②斜麵孢子培養。在無菌條件下，用接種環蘸取安瓿瓶中冷凍孢子，劃線接種到裝有察氏培養基的固體斜麵上，25～28℃下恒溫培養6～7d後，培養基表麵呈孢子顏色，鏡檢有大量孢子產生，培養結束，放入冰箱冷藏備用。
③大米孢子培養。將優質新米用水浸透（12～24h），然後倒入搪瓷盤內蒸15min（使大米粒仍保持分散狀態）。蒸畢，取出搓散團塊，稍冷，可加0.5％～1.0％玉米漿，分裝於茄形瓶內，蒸汽滅菌（121℃30min），冷卻備用。取上麵製備好的斜麵孢子管，加入少量無菌水，製成孢子懸液，無菌條件下接入到裝有大米的茄形瓶中，培養過程中要注意翻動，使菌絲在大米表麵能均勻生長，待10d左右形成綠色孢子即可收獲，真空冷凍幹燥後備用（最好在10d內使用）。
④產黃青黴菌株的保存。準備一幹燥、無菌的小濾紙條，伸入斜麵孢子試管中（無菌操作），輕輕蘸取培養基表麵的孢子少許，再將該濾紙條裝入一無菌的空試管中，加塞後，可長期冷凍保存。也可先製備好孢子懸液，倒入裝有經滅菌、烘幹處理的沙土管中，與管中沙土混勻後，將沙土管放在盛有無水氯化鈣的幹燥器中，用真空泵抽氣幹燥，置低溫幹燥環境下可保存1年以上。若將茄形瓶中培養成熟的大米孢子，取出置冰箱中，可保存1～3年。
⑤青黴菌直接製片觀察。用接種鉤或解剖針從試管或培養皿的菌落邊緣交界處，挑取少量產黃青黴菌株培養物，浸入載玻片上的乳酸石炭酸棉藍染液液滴內。用兩根解剖針小心地將菌絲團分散開，使其不纏結成團，並將其全部浸濕，然後蓋上蓋玻片並輕輕按壓，盡量避免產生氣泡。如有氣泡可慢慢加熱除掉。將製好的載片標本置於低倍鏡下觀察，必要時換用高倍鏡。鏡檢時能看到在青黴的有隔菌絲上長出直立的分生孢子梗，梗的頂端以帚狀非對稱式分枝形成梗基和瓶形小梗，小梗上長有成串的分生孢子（產黃青黴菌株區別於其他雜菌的明顯特征）。
（2）產黃青黴菌株的液體種子培養
①液體培養基的配製及實消。種子培養基（％）：玉米漿4.0（以幹物質計），蔗糖2.4，硫酸銨0.4，碳酸鈣0.4，少量新鮮豆油（消泡）；pH6.2～6.5。體積不超過種子罐有效容積的0.6～0.7。實消參數采用罐壓0.12MPa（文中所述罐壓皆為表壓），罐溫121～123℃，30min；然後立即打開冷卻水閥，向夾套通水，快速冷卻；罐壓降到0.05MPa時，打開空氣閥門，向罐內通入無菌空氣，保持罐壓為0.05MPa，繼續通冷卻水，直到罐內培養基溫度降至略高於接種溫度2℃（27℃）時，關閉閥門，停止通冷卻水，準備接種。
②一級液體菌種培養。采用火焰封口接種法，將新鮮的大米孢子接入裝有液體培養基且實消好的5L種子罐中，參考接種量：100～200g/L。25℃下培養56h，攪拌轉速110r/min，空氣流量：0～50h為0.5vvm，50h後為1.0vvm，培養至對數生長後期移種（移種標準是外觀微黃較稠，菌絲濃度（體積）10％～12％，菌絲細長，均勻無空泡）。
（3）產黃青黴菌株的二級發酵培養
①10L發酵培養基製備及實消。發酵培養基（％）：玉米漿3.8（以幹物質計），乳糖5.0，苯乙酸0.5～0.8（考慮流加），新鮮豆油0.5（流加），磷酸二氫鉀0.54，無水硫酸鈉0.54，碳酸鈣0.07，硫酸亞鐵0.018，硫酸錳0.0025；pH4.7～4.9。實消參數同一級液體種子培養基。
②接種及發酵。采用壓差接種法，接種前先進行移種管道空消，待管道冷卻後，逐漸增大種子罐罐壓（0.20～0.40MPa），此時發酵罐罐壓維持在0.05～0.10MPa。依次開啟由種子罐到發酵罐的移種管道閥門，完成接種。10L發酵液的接種用量為1.0～1.5L（10％～15％），如接種量小可參考采用液體搖瓶製種。發酵期間主要控製參數：溫度25℃，罐壓0.04～0.10MPa，攪拌轉速120～130r/min，空氣流量為0.50～0.95vvm。當發酵液中氨氮含量下降至450μg/mL以下時，開始補加硫酸銨。在後續發酵過程中控製發酵液氨氮含量為300～500μg/mL，並在線監控溶氧（DO）和pH，考察發酵期間的最大菌絲濃度、氨氮代謝、糖代謝、發酵周期、放罐效價等參數。
③發酵終點確定。根據“鏡檢”判斷，若菌絲中空泡擴大、增多及延伸，在自溶期即將來臨之際，迅速停止發酵，立刻放罐，作好發酵液的預處理，準備進行發酵產物的提取。
5）結果分析與討論
將參與實訓學生進行分組，各組組長兼任安全員，副組長兼任設備材料員，達到學生的自管自治和相互監督、學生與教師的高度配合。
①完成產黃青黴菌株的擴大培養、檢驗及保存任務後，各小組分別展示無菌檢驗結果、產黃青黴菌株經染色後顯微鏡下形態、產黃青黴菌株的凍幹製品。首先，進行組內自我評價和組間互評；接著，教師對每組結果進行評價，指出存在的問題和改進的方法。（評價項目包括：a.斜麵菌種。產黃青黴菌株轉管培養後，斜麵長度適宜，軟硬適中，光滑，表麵無遊離水，外觀生長均勻，孢子或菌體豐滿，無汙染，無雜菌雜色等。b.米孢子。無汙染，孢子數足，發芽率高，生產能力穩定。c.產黃青黴菌株經染色後顯微鏡下形態菌絲稠密，菌絲團很少，菌絲粗壯，有中、小空泡。d.凍幹菌種。外觀形狀呈疏鬆的海綿狀；菌種的真空度檢測出現紫色輝光。）
②完成產黃青黴菌株發酵培養基配製與發酵後，各小組分別彙報發酵過程中染菌情況以及產黃青黴菌株抽樣檢驗情況，並展示革蘭氏染色標本片以及乳酸石炭酸棉藍染色標本片。然後，組內進行自我評價和組間互評。接著，教師對每組結果具體進行評價和打分。
教師對於產黃青黴菌株發酵培養液無雜菌汙染、且有效發酵的組別給予表揚，並對製備的青黴素發酵液進行低溫儲存，以備後期過濾、提煉等。對於產黃青黴菌株發酵培養液有雜菌汙染或無效發酵的組別，指出存在的問題和改進的方法。（評價項目包括：發酵液無雜菌汙染、鏡檢檢查結果符合青黴菌生長發育過程。）
①抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和動物在內）在其生命活動過程中產生的，能在低濃度下有選擇地抑製或殺滅他種生物機能的低分子量的有機物質。
②本項目先對青黴素作了簡要介紹，包括青黴素的發現、化學結構、理化性質。理化性質中的溶解度、吸濕性、穩定性，是青黴素生產、提取及精製過程中工藝條件控製的重要考慮因素。之後在青黴素發酵生產工藝中闡述了其生產原理、發酵工藝過程以及提取和精製工藝過程。在講述生產原理時，介紹了青黴素的生產菌種及其生長發育特點和培養方法，以及青黴素的生物合成原理。隻有明白了青黴素的生物合成原理，我們才知道如何進行青黴素生產的代謝調控，使得發酵生產向有利於提高產量的方向進行。
③發酵工藝過程包括發酵工藝流程介紹和工藝控製兩部分內容。其中工藝控製包括種子質量的控製、培養基成分的控製和發酵培養條件的控製。青黴素的提取和精製工藝過程，包括工藝流程介紹和提取、精製工藝控製要點兩部分內容。其中工藝控製包括預處理及過濾、萃取、脫色和結晶4個階段。
④以10L青黴素的發酵實訓為例對青黴素發酵過程中菌種的擴培、保存、發酵過程控製進行了具體操作指導。
1.青黴素化學結構有何特點？寫出其抗菌機理。
2.青黴素產生菌是什麼？寫出其生長發育各階段的主要特征。
3.青黴素生產的主要原理是什麼？
4.如何進行種子罐的火焰封口接種操作？
5.青黴素發酵液預處理的目的是什麼？生產中采用的方法是什麼？
6.試述青黴素鉀鹽結晶的方法有哪些？並分析水分、酸度、溫度及醋酸鉀用量對生產有何影響？