青黴素是產黃青黴菌株在一定的培養條件下發酵產生的。生產上一般將米孢子接入種子罐經二級擴大培養後，移入發酵罐進行發酵，所製得的含有一定濃度青黴素的發酵液經適當的預處理，再經提煉、精製、成品分包裝等工序最終製得合乎藥典要求的成品。
（1）生產菌種
青黴素最初生產菌為點青黴（又稱音符型青黴菌），生產能力僅為幾十個單位，不能滿足工業生產需要。後來發現適合深層培養的新菌種——產黃青黴，生產能力100U/mL，經不斷誘變選育，目前平均生產能力66000～70000U/mL，國際最高生產能力已超過100000U/mL。
（2）菌體的生長發育
產黃青黴在液體深層培養中菌絲可發育為兩種形態，即球狀菌和絲狀菌。在整個發酵培養過程中，產黃青黴的生長發育可分為6個階段：
①分生孢子萌發，形成芽管，原生質未分化，具有小泡，為Ⅰ期。
②菌絲繁殖，原生質嗜堿性很強，有類脂肪小顆粒產生，為Ⅱ期。
③原生質嗜堿性仍很強，形成脂肪粒，積累儲藏物，為Ⅲ期。
④原生質嗜堿性減弱，脂肪粒減少，形成中、小空泡，為Ⅳ期。
⑤脂肪粒消失，形成大空泡，為Ⅴ期。
⑥細胞內看不到顆粒，並有個別自溶細胞出現，為Ⅵ期。
Ⅰ～Ⅳ期為菌絲生長期，Ⅲ期的菌體適宜為種子。Ⅳ～Ⅴ期為生產期，生產能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產。在第Ⅵ期到來之前結束發酵。實際生產中，按規定時間取樣，對青黴菌形態變化進行鏡檢，便於控製發酵。
（3）青黴素產生菌的培養
種子培養階段以產生豐富的孢子（斜麵和米孢子培養）或大量健壯菌絲體（種子罐培養）為主要目的。因此，在培養基中應加入豐富易代謝的碳源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米漿）、緩衝pH的碳酸鈣以及生長所必需的無機鹽，並保持最適生長溫度25～26℃和充分的通氣攪拌，使菌體量倍增達到對數生長期，此期要嚴格控製培養條件及原材料質量以保持種子質量的穩定性。
（4）青黴素的生物合成
產黃青黴菌在發酵過程中首先合成其前體，即α氨基己二酸、半胱氨酸、纈氨酸，再在三肽合成酶的催化下，Lα氨基己二酸（αAAA）與L半胱氨酸形成二肽，然後再與L纈氨酸形成三肽化合物，稱α氨基己二酰半胱氨酰纈氨酸（構型為LLD），其中纈氨酸的構型必須是L型才能被菌體用於合成三肽。在三肽的形成過程中，L纈氨酸轉為D型。
三肽化合物在環化酶的作用下閉環形成異青黴素N，異青黴素N中的αAAA側鏈可以在酰基轉移酶作用下轉換成其他側鏈，形成青黴素類抗生素。如果在發酵液中加入苯乙酸，就形成青黴素G。產生菌菌體內酰基轉移酶活性高時，青黴素產量就高。對於生產菌，如果其各代謝通道暢通就可大量生產青黴素。因此，代謝網絡中各種酶活性越高，越利於生產，對各酶量及各酶活性調節是控製代謝通量的關鍵。產黃青黴生產青黴素受以下方式的調控：
①受碳源調控。青黴素生物合成途徑中的一些酶（如酰基轉移酶）受葡萄糖分解產物的阻遏。
②受氮源調控。NH+4濃度過高，阻遏三肽合成酶、環化酶等。
③受終產物調控。青黴素過量能反饋調節自身生物合成。
④受分支途徑調控。產黃青黴在合成青黴素途徑中，分支途徑中L賴氨酸反饋抑製共同途徑中的第一個酶——高檸檬酸合成酶。
2）發酵工藝過程
（1）工藝流程
①絲狀菌三級發酵工藝流程：冷凍管（孢子）→斜麵母瓶（25℃，孢子培養，7d）→大米孢子（25℃，孢子培養，7d）→一級種子培養液（26℃，種子培養，56h）→二級種子培養液（27℃，種子培養，24h，1.5vvm）→發酵液（26～27℃，發酵，7d，0.95vvm）。
②球狀菌二級發酵工藝流程：冷凍管（孢子）→親米孢子（25℃，孢子培養，6～8d）→生產米孢子（25℃，孢子培養，8～10d）→種子培養液（28℃，菌絲體培養，56～60h，1.5vvm）→發酵液（前期為26℃，後期降到24℃，發酵，7d，0.8vvm）［vvm：單位時間（min）單位發酵液體積（L）內通入的標準狀態下的空氣體積（L），即L/（L·min）］。
（2）工藝控製要點
青黴素發酵是給予最佳條件培養菌種，使菌種在生長發育過程中大量產生和分泌抗生素的過程。發酵過程的成敗與種子的質量、設備構型、動力大小、空氣量供應、培養基配方、合理補料、培養條件等因素有關。發酵過程控製就是控製菌種的生化代謝過程，必須對各項工藝條件加以嚴格管理，才能做到穩定發酵。青黴素發酵屬於好氧發酵過程，在發酵過程中，需不斷通入無菌空氣並攪拌，以維持一定的罐壓和溶氧。整個發酵階段分為生長和產物合成兩個階段。前一個階段是菌絲快速生長，進入生產階段的必要條件是降低菌絲生長速度，這可通過限製糖的供給來實現。
①種子質量的控製。絲狀菌的生產種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管（孢子）經甘油、葡萄糖、蛋白腖斜麵移植到小米或大米固體上，25℃培養7d，孢子發育成熟，真空幹燥並以這種形式保存備用。生產時把它（孢子）按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內，26℃培養56h左右，菌絲濃度達6％～8％，菌絲形態正常，按10％～15％的接種量移入含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內，27℃培養24h，菌絲體積10％～12％，形態正常，效價在700U/mL左右便可作為發酵種子。
球狀菌的生產種子是由冷凍管孢子經混有0.5％～1.0％玉米漿的三角瓶培養原始親米孢子，然後再移入羅氏瓶培養生產大米孢子（又稱生產米），親米和生產米均為25℃靜置培養，需經常觀察生長發育情況，在培養3～4d，大米表麵長出明顯小集落時要振搖均勻，使菌絲在大米表麵能均勻生長，待10d左右形成綠色孢子即可收獲。親米成熟接入生產米後也要經過激烈振蕩才可放置恒溫培養，生產米的孢子量要求每粒米300萬隻以上。親米、生產米孢子都需保存在5℃冰箱內。
工藝要求將新鮮的生產米（指收獲後的孢子瓶在10d以內使用）接入含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內，28℃培養50～60h。當pH由6.0～6.5下降至5.0～5.5，菌絲呈菊花團狀，平均直徑在100～130μm，每毫升的球數為6萬～8萬隻，沉降率在85％以上，即可根據發酵罐球數控製在8000～11000隻/mL範圍的要求，計算移種體積，然後接入發酵罐，多餘的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳，其生產水平優於真空幹燥的孢子，能使青黴素發酵單位的罐批差異減少。
②培養基成分的控製。
a.碳源。產黃青黴菌可利用的碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。目前生產上普遍采用的是澱粉水解糖、糖化液（DE值50％以上）進行流加。
b.氮源。氮源常選用玉米漿、精製棉籽餅粉、麩皮，並補加無機氮源（硫酸銨、氨水或尿素）。
c.前體。生物合成含有苄基基團的青黴素G，需在發酵液中加入前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量不大於0.1％，並采用多次加入，以防止前體對青黴素的毒害。
d.無機鹽。加入的無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等，且用量要適度。另外，由於鐵離子對青黴菌有毒害作用，必須嚴格控製鐵離子的濃度，一般控製在30μg/mL。
③發酵培養的控製。
a.加糖控製。加糖量的控製是根據殘糖量及發酵過程中的pH確定，最好是根據排氣中CO2量及O2量來控製，一般在殘糖降至0.6％左右，pH值上升時開始加糖。
b.補氮及加前體。補氮是指加硫酸銨、氨水或尿素，使發酵液氨氮控製在0.01％～0.05％，補前體以使發酵液中殘存苯乙酰胺濃度為0.05％～0.08％。
c.pH控製。對pH的要求視不同菌種而異，一般為pH6.4～6.8，可以補加葡萄糖來控製。目前一般采用加酸或加堿控製pH。
d.溫度控製。前期25～26℃，後期23℃，以減少後期發酵液中青黴素的降解破壞。
e.溶解氧的控製。一般要求發酵中溶解氧量不低於飽和溶解氧的30％。通風比一般為0.8L/（L·min），攪拌轉速在發酵各階段應根據需要而調整。
f.泡沫的控製。在發酵過程中產生大量泡沫，可以用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化學合成消泡劑“泡敵”來消泡，應當控製其用量並要少量多次加入，尤其在發酵前期不宜多用，否則會影響菌體的呼吸代謝。
g.發酵液質量控製。生產上按規定時間從發酵罐中取樣，用顯微鏡觀察菌絲形態變化來控製發酵。生產上慣稱“鏡檢”，根據“鏡檢”中菌絲形態變化和代謝變化的其他指標調節發酵溫度，通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發酵時間，以獲得最多青黴素。當菌絲中空泡擴大、增多及延伸，並出現個別自溶細胞，這表示菌絲趨向衰老，青黴素分泌逐漸停止，菌絲形態上即將進入自溶期，在此時期由於菌絲自溶，遊離氨釋放，pH上升，導致青黴素產量下降，使色素、溶解和膠狀雜質增多，並使發酵液變黏稠，增加下一步提純時過濾的困難。因此，生產上根據“鏡檢”判斷，在自溶期即將來臨之際，迅速停止發酵，立刻放罐，將發酵液迅速送往提煉工段。
3）提取和精製工藝過程
（1）工藝流程（注射用青黴素鉀鹽為例）
（2）提取和精製工藝控製要點
青黴素不穩定，發酵液預處理、提取和精製過程應注意條件溫和、速度快，以防止青黴素被破壞。預處理及過濾、提取過程是青黴素各產品生產的共性部分，其工藝控製基本相同，隻是精製過程有所差別。
①預處理及過濾。預處理是進行分離純化的第一個工序。發酵液結束後，目標產物存在於發酵液中，而且濃度很低，僅0.1％～4.5％，而雜質濃度比青黴素高幾十倍甚至幾千倍，它們影響後續工藝的有效提取，因此必須對其進行預處理。目的在於濃縮目的產物，去除大部分雜質，改變發酵液的流變學特征，利於後續的分離純化過程。
發酵液放罐後，首先要冷卻至10℃以下。因為青黴素在低溫時比較穩定，同時細菌繁殖也較慢，可避免青黴素被迅速破壞。再加入少量絮凝劑用以沉澱蛋白，然後經真空過濾機過濾，除掉菌絲體及部分蛋白。所得濾渣成緊密餅狀，易從濾布上刮下。濾液pH6.2～7.2，蛋白質含量0.05％～0.2％。這些蛋白質的存在對後麵提取有很大影響，必須加以除去。通常采用10％H2SO4調節pH至4.5～5.0，加入0.07％溴代十五烷吡啶（PPB），同時再加入0.7％矽藻土作為助濾劑（增加過濾速度），再通過板框過濾機進行二次過濾，所得濾液一般澄清透明，可進行萃取。
②萃取。青黴素的提取采用溶媒萃取法。青黴素遊離酸易溶於有機溶劑，而青黴素鹽易溶於水。利用這一性質，在酸性條件下青黴素轉入有機溶媒中；調節pH，再轉入中性水相；反複幾次萃取，即可提純濃縮。應選擇對青黴素分配係數高的有機溶劑，工業上通常用乙酸丁酯（簡稱BA）和戊酯。萃取2～3次。從發酵液萃取到乙酸丁酯（BA）時，pH選擇1.8～2.2範圍內，從乙酸丁酯（BA）反萃取到水相時，pH選擇6.8～7.4範圍內。發酵濾液與乙酸丁酯（BA）的體積比為1.5～2.1，即一次濃縮倍數為1.5～2.1。為了避免pH波動，可用磷酸鹽、碳酸鹽緩衝液進行反萃取。發酵液與溶劑比例為3～4。幾次萃取後，濃縮10倍，濃度幾乎達到結晶要求。萃取總收率在85％左右。