王敦是個聰明人，不難看出司馬睿此舉的別有用心。然而，北伐名將祖逖等人的存在，讓王敦自知不是對手，所以一直沒敢動手。大興四年（321）九月，祖逖病逝，王敦自認為天下無敵，起兵對抗朝廷的計劃也隨之提上了日程。永昌元年（322）正月，王敦以誅殺劉隗為名再次上疏，並在武昌起兵叛亂，江南大族沈充也起兵響應。在奏疏中，王敦還以“隗首朝懸，諸軍夕退”，來威脅司馬睿就範。王敦兵至蕪湖時，又上表大談刁協的罪狀，讓司馬睿殺掉刁協。王敦甚至還提出，如不按照他的意思辦，就像伊尹幽禁商太宗太甲那樣，讓司馬睿以此改過自省，重新做人。司馬睿“大怒”道：“是可忍也，孰不可忍也！”
生氣歸生氣，但王敦實力不容小覷，為此，司馬睿又開始籠絡王導。永昌元年（322）三月，司馬睿以王導為前鋒大都督，自己親率軍隊迎戰，急招戴淵、劉隗前來救援。然而，關鍵時刻，守城將周劄開門投降，王敦兵不血刃就打進了石頭城。司馬睿忙命刁協、劉隗、戴淵等人奪回石頭城，但均遭大敗。戴淵、刁協被殺，劉隗投奔石勒，司馬睿一敗塗地，“官省奔散，惟有侍中二人侍帝”。無奈之下，司馬睿“脫戎衣，著朝服”對王敦說：“欲得我處，但當早道，我自還琅邪，何至困百姓如此！”意思是說，王敦你如果想當皇帝，早和我說啊，我把皇位讓給你，還當我的琅邪王去。何苦讓百姓跟著受苦呢？在曆代開國皇帝中，能被臣子搞得這樣狼狽，這麼窩囊，這般沒有尊嚴的，司馬睿是第一個，也是唯一一個。
司馬睿近似哀求的話，並沒有撫平王敦的狼子野心。不久，王敦便自己為自己加官進爵，“敦乃自為丞相、都督中外諸軍、錄尚書事”。司馬睿征討王敦時，曾下令“有殺敦者，封五千戶侯”，而王敦卻把自己“封武昌郡公，邑萬戶”，無疑又將司馬睿嘲弄了一番。司馬睿稱帝前積累的那點人氣，如今已是蕩然無存；皇帝徒具虛名而已，朝中任何事情都由王敦作主。王敦看到太子司馬紹有勇有謀，便想以不孝而廢之，後因百官皆不從而作罷。四月，王敦還師武昌，遙控朝政。七月，王敦“自領寧、益二州都督”。此後，王敦更加猖狂，以至於“四方貢獻多入己府，將相嶽牧悉出其門”，司馬睿和他的朝廷顯然成了擺設。
司馬睿眼睜睜地看著王敦飛揚跋扈，逼辱朝廷，蔑視皇權，卻沒有一點辦法。永昌元年（322）閏十一月，司馬睿在極度鬱悶和窩囊中去世，享年四十七歲。關於他的死，《資治通鑒》稱“帝憂憤成疾，閏月，己醜，崩。”《魏書》稱“睿畏迫於敦，居常憂戚，發病而死。”《晉書》稱“閏月己醜，帝崩於內殿”，未提死因，顯然是為司馬睿留了麵子。司馬睿死後，兒子司馬紹即位，繼續受製於王敦。太寧二年（324）六月，王敦病死。司馬紹在鏟除其黨羽之後，下令將王敦“發瘞出屍，焚其衣冠，跽而刑之”，總算為父親司馬睿出了口惡氣。不過這一幕，司馬睿是永遠都看不到了。車身全靠車頭帶，一個王朝也不例外。東晉後來的皇帝大都受到權臣的掣肘，這不能不說是受開國皇帝司馬睿“失馭強臣，自亡齊斧”的負麵影響。