隨著免疫測定方法應用的日新月異，相關的方法學以及技術也在不斷發展。對測定方法的快速、低試劑消耗、簡單的操作步驟以及標準曲線的長期穩定等特性要求仍很重要，但同時也對方法靈敏度、特異性和精確性的要求越來越高。建立於20世紀70年代的化學發光免疫學分析技術（chemiluminescentimmunoassay，CLIA）即是將光反應的高靈敏度和免疫學反應的特異性相結合的一種方法，CLIA將化學發光物質與免疫學反應結合起來。該法克服了放射性標記免疫測定法的諸多不足，與酶聯免疫反應相比較，後者由於使用顯色底物，吸光度比色遵循比爾定律，標準曲線直線範圍較窄，而CLIA無此限製。熒光免疫測定受自然熒光的幹擾，影響檢測的敏感性，而在免疫分析材料或生物樣品中幾乎沒有化學發光現象，CLIA可得到較高的信噪比，敏感度可大提高。基於以上的優越性，20世紀90年代以後各種CLIA自動分析儀器相繼問世，可與生化自動分析儀相媲美。CLIA具有非常廣闊的發展前景，可以用於免疫物質的定性、定量和生物細胞活性功能測定，所用的多種發光劑可以由實驗室研究方法配製或有成品試劑盒供應。
一、化學發光
在化學反應中生成的激發態產物，在返回到基態是所發出的光稱為化學發光（chemiluminescence，CL）。其反應過程可以用下式表示。
A+B→C—+D
C—→C+hν（光）
將在化學發光反應中參與能量轉移，並最終以發射光子的形式釋放能量的化合物稱為化學發光劑或發光底物。在發光性反應中，反應係統放出的自由能傳遞到反應的效價電子上，使其受激由基態向激發態躍遷，而激發態的物質極不穩定，很快以光子的形式把能量釋放出來回到基態。釋放出光量子，其能量ΔE即激發態（E2）和基態（E1）之能量差。
ΔE＝E2-E1＝hν＝hc/λ
其中h為普氏常數，ν為光子的頻率，λ為波長，c為光速。現已知道光量子在波長560nm～400nm範圍內，激發光反應的最低能量不低於44kcal/mol，因此隻有一些有氧、過氧化物和強氧化劑的物質參與的反應才會出現發光現象。
二、常用的化學發光劑
在化學發光免疫學測定中能夠作為發光物質需要具備下列條件：①參與的發光反應的量子產率高；②其理化特性與所研究的體係相匹配；③其發光反應是發光物質在氧化反應後的結果；④在所使用的濃度範圍內對機體無毒無害。符合以上條件的常用化學發光劑有如下幾種。
（一）氨基苯二酰肼類
主要為魯米諾、異魯米諾及其衍生物，是最常用的一類化學發光劑。它在化學發光反應中既可以用作標記物，也可以作為過氧化物酶的底物。發射光的波長範圍為375～550nm，以425nm為主。魯米諾（5氨基2，3二氫1，4酞嗪二酮）的化學機構及發光化學反應式如下。
異魯米諾（6氨基2，3二氫1，4酞嗪二酮）可以在6位氨基進行烷基取代，製得各種衍生物，其中ABEI（氨丁基乙基異魯米諾）、AHEI（氨己基乙基異魯米諾）和ABENH（氨丁基乙基氨萘二酰肼）較為常用，在化學免疫發光測定取得較好的應用效果。
（二）吖啶酯
吖啶酯（acridiniumester，AE）也是一種廣泛應用的化學發光示蹤劑。吖啶酯是一個三環的有機化合物，其氧化無需催化劑的存在，隻需在有過氧化物的稀溶液中即可發生多價鍵的斷裂，經過一個二氧酮的中間體，產生1個電子激發的10甲基吖啶酮，當10甲基吖啶酮回複到基態時在430nm處釋放光子。其發光反應方程式如下。
吖啶酯作為一種免疫分析示蹤物具有很多優點。首先，無需催化劑，反應簡化。發光快速，增加了計數的充分性，背景噪聲低，且信噪比高。檢測極限可達5×10-9mol。其次，其優勢還在於當吖啶酯和蛋白質、多肽或其他有機化合物形成免疫示蹤物時，結合發生在分子的一定部位，當吖啶酯分子在氧化過程中就可從發光的部位斷裂並分離開來。排除了結合作用對產光過程的抑製作用，因此敏感度增加。另外，與其他的化學發光劑相比較，吖啶酯是一種極為穩定的示蹤物，控製好發光反應的條件後，其發光量和吖啶酯的濃度可呈良好的線性關係。
（三）咪唑類
咯粉堿是典型的咪唑類發光性物質，氧化劑如H2O2、NaClO和氧氣與其反應。反應過程首先是咯粉堿在堿性二甲亞碸形成氧化物的中間體，再進行重排後進一步降解，伴隨著光子的產生。其發光反應方程式如下。
（四）苯酚類化合物
用於化學發光免疫學測定的酚類物質主要有鄰苯三酚，此外還有芳基草酸酯類包括TCPD，即雙（2，4，6三氯苯基）草酸酯以及DNPO，即雙（2，4二硝基苯基）草酸酯。鄰苯三酚是一種強的還原劑，在催化劑如血紅素、HRP催化下，與過氧化氫反應釋放出光能。反應過程如下。芳基草酸酯類物質的發光反應是通過草酸酯中間產物，在反應體係中加入一種熒光染料作為熒光載體，以捕獲化學能，並使其轉化為可見光，同時也可以加強了發光效率。
鄰苯三酚H2O2/HRP各類氧化物+hν
（五）1，2二氧環乙烷衍生物
以1，2二氧環乙烷衍生物為底物的堿性磷酸酶是另外一類的化學體係，它可以解決化學發光檢測反應遇到的許多問題，如3（2′螺金剛烷）4甲氧基4（3′磷酰氧基）苯基1，2二氧環乙烷（AMPPD）能夠有效地被堿性磷酸酯酶（ALP）所分解，脫去一個磷酸酯，生成中間產物AMPPD-，該中間產物分解成為一分子的金剛烷酮和一分子處於激發態的間氧苯甲酸甲酯陰離子，後者從激發態到基態時，產生量子效率的光輻射。
AMPPDALP化學發光體係具有如下優點：參與化學反應的組分少，底物可直接被激活產生化學發光，從而減少體係的複雜性和背景的幹擾，由於酶的參與使其分解具有較高的轉換率，光輻射量子產率高且光信號可以持續數小時至到數天，檢測的靈敏度和特異性得到提高。
三、化學發光免疫學分析的分類
（一）種類
按標記物的不同，發光免疫學分析有以下5種。
1.化學發光免疫學分析標記物為氨基酰肼類及其衍生物如5氨基2，3二氫1，4酞嗪二酮（魯米諾）和異魯米諾等。
2.化學發光酶免疫學分析是用酶標記抗原或抗體，如辣根過氧化物酶（HRP）或者堿性磷酸酶（ALP），在反應的終點再用魯米諾測定其發光的強度。
3.微粒子化學發光免疫學分析標記物為二氧乙烷磷酸酯（AMPPD）等。
4.生物發光免疫學分析熒光素標記抗原或者抗體，直接或者間接參加發光反應。
5.電化學發光免疫學分析所用的發光試劑為三氯聯吡啶釕[Ru（bpy）3]2+。
（二）檢測方法
按檢測的形式可分為如下3種。
1.液相法免疫反應在液相中進行，反應後經離心或分離後，再進行發光測定。
2.固相法抗原或者抗體固定在固相載體或沉澱物上，再測發光強度，該法最常用。
3.均相法免疫反應在液體中進行，反應後不經離心或分離，直接測定發光強度。
四、化學發光免疫學測定技術
（一）化學發光免疫學分析