免疫膠體金技術是以膠體金作為標誌物，應用於抗原抗體檢測的一種新型的免疫標記技術。該技術於20世紀70年代初期由Faulk和Taylor始創，最初用於免疫電鏡技術，隨著技術的不斷改進和完善，免疫膠體金技術已建立了免疫轉印、免疫金銀染色法、斑點免疫滲濾試驗和斑點免疫層析試驗等多種免疫標記檢測方法，成為目前免疫組織化學技術中較常用的方法之一。
一、膠體金的特性及製備
（一）膠體金的結構
膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsol），是由金鹽還原成原子金後形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構成，緊連在金核表麵的是內層負離子（AuCl2-），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金遊離於溶膠間的懸液狀態。
膠體金顆粒的基礎金核並非是理想的圓球核，較小的膠體金顆粒基本是圓球形，較大的膠體金顆粒（大於30nm以上）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態。
（二）膠體金的特性
1.膠體性質膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒穩定均勻地呈單一分散狀態懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金具有膠體的多種特性，特別是對電解質的敏感性。電解質能破壞膠體金顆粒的外周水化層，從而打破膠體的穩定狀態，使分散的單一金顆粒凝聚成大顆粒，從而在液體中沉澱。
2.呈色性微小顆粒膠體金呈紅色，不同大小的膠體金呈色有一定的差別。最小的膠體金（2～5nm）呈橙黃色，中等大小的膠體金（10～20nm）呈酒紅色，較大顆粒的膠體金（30～80nm）則呈紫紅色。根據此特點，可用肉眼觀察膠體金的顏色粗略估計金顆粒的大小。
3.光吸收性膠體金在可見光範圍內有單一的光吸收峰，最大吸收波長（λmax）在510～550nm範圍內，並隨膠體金顆粒大小而變化，大顆粒膠體金的λmax偏向長波長，小顆粒膠體金的λmax則偏向短波長。
（三）膠體金的製備
膠體金的製備多采用還原法，其原理是：在氯金酸（HAuCl4）水溶液中加入一定量的還原劑，使金離子還原為金原子。常用的還原劑有枸櫞酸鈉、鞣酸、白磷、抗壞血酸、硼氫化鈉等。根據還原劑類型以及還原作用的強弱，可以製備0.8～150nm大小不等的膠體金。最常用的製備方法如下。
1.枸櫞酸三鈉還原法（Frens法）取0.01%HAuCl4水溶液100ml加熱至沸，迅速加入1%枸櫞酸三鈉水鎔液4ml，繼續加熱，直至溶液變紅為止（約5min），所獲膠體金顆粒直徑約15nm。此過程可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在枸櫞酸三鈉加入後很快變灰色，續而轉成黑色，隨後逐漸穩定成紅色。通過改變枸櫞酸三鈉的用量（分別減至2.5ml、1.0ml、0.75ml）可以製得不同大小的膠體金顆粒（直徑分別增為18～20nm、30nm、50nm）。
2.鞣酸-枸櫞酸三鈉還原法（Slot法）原理是通過改變鞣酸含量控製膠體金顆粒的大小。製備方法簡單，適用於雙重和多重標記。根據所需膠體金顆粒直徑的大小分別將A、B兩液同時預熱至60℃，在磁性攪拌下將A液迅速加入B液，溶液變藍，繼續加熱攪拌至溶液變成亮紅色（紅葡萄酒樣）。
3.製備膠體金的注意事項①氯金酸易潮解，應幹燥、避光保存；氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，配製時不應使用金屬藥匙；1%氯金酸水溶液在4℃條件下可穩定保持數月。②玻璃器皿必須嚴格清洗，用前應經酸洗並用雙蒸水衝淨，最好是經過矽化處理的玻璃器皿，或用第1次配製的膠體金穩定的玻璃器皿，再用雙蒸水衝洗後使用。否則影響生物大分子與金顆粒結合和活化後金顆粒的穩定性，不能獲得預期大小的金顆粒。③所有試劑都必須使用雙蒸水或三蒸水配製，最好用0.45μm微孔濾膜過濾，以除去其中的聚合物和其他可能混入的雜質。④配製的膠體金溶液以pH7.2為宜。
（四）膠體金的鑒定和保存
製好的膠體金應鑒定，主要檢查指標有顆粒大小、粒徑均勻度以及有無凝集顆粒等。肉眼觀察是最基本也是最簡單、方便的鑒定方法，但需要一定的經驗。理想的膠體金應該是清亮透明，大小基本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒。在日光下仔細觀察比較膠體金的顏色，可以粗略估計製得的金顆粒的大小；也可用分光光度計掃描λmax估計金顆粒的粒徑。製備的膠體金最好電鏡觀察，拍片放大後，可以比較精確地測定膠體金的平均粒徑。
製備合格的膠體金後，放室溫或4℃條件下保存，避免低溫凍存，凍存可導致膠體金凝集，破壞膠體狀態。膠體金在潔淨的玻璃器皿中可較長時間保存，加入少許防腐劑（如0.02%NaN3）有利於保存。膠體金具有不穩定性和沉聚性，製備完畢後最好在20天以內進行標記。少量凝集顆粒不影響標記，使用時可先低速離心去除凝集顆粒以提高標記效率。
二、免疫金的特性和製備
（一）免疫金的特性
膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，在免疫組織化學技術中，習慣將膠體金結合蛋白質的複合物稱為金探針。用於免疫測定時膠體金多與抗原或抗體結合，稱為免疫金複合物，簡稱免疫金（immunogold）。
膠體金與蛋白質結合的機製尚不清楚，一般認為是通過物理吸附結合。膠體金顆粒表麵帶負電荷，與蛋白質的正電荷基團通過靜電力相互吸引，達到範德華引力範圍內即形成牢固的結合，這種結合不影響蛋白質生物活性和免疫活性。此外，膠體金顆粒的粗糙表麵也是形成吸附的重要條件。膠體金對蛋白的吸附主要取決於pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低於蛋白質的等電點，則會聚集而失去結合能力。膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等也影響膠體金與蛋白質的結合。