（二）免疫金的製備
1.待標記蛋白質的準備蛋白質溶液含鹽量較高或形成聚合物極易影響標記過程，因此，將待標記蛋白預先在0.005mol/LpH7.0NaCl溶液中4℃條件下透析過夜，除去多餘的鹽離子，然後100000×g4℃條件下離心1h，去除聚合物。
2.膠體金pH值的調整膠體金與蛋白質的結合成功與否，取決於pH值，一般隻有在蛋白質等電點略偏堿的條件下二者才能牢固地結合。因此，標記前須將膠體金溶液的pH值調至待標記蛋白質的等電點略偏堿。通常用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl調整膠體金溶液的pH值。標記IgG時pH值9.0；標記McAb時pH值8.2；標記親和層析抗體時pH值7.6；標記SPA時，pH值5.9～6.2；標記ConA時pH值8.0；標記親和素時pH值9～10。
膠體金溶液可能損壞pH計的電板，用精密的pH試紙測定即可。也可先用終濃度為0.1%的聚乙二醇（PEG20000）穩定膠體金後，測定其pH值。
3.膠體金與標記蛋白用量之比的確定將待標記蛋白作一係列稀釋，各取0.1ml加入裝有1ml膠體金的試管中，混勻，5min後再在上述試管中分別加入0.1ml10%NaCl，混勻後靜置2h，觀察結果。對照管（不加蛋白質）和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅色不變。其中以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量，為該標記蛋白質的最低用量，實際工作中，可適當增加10%～20%。
4.蛋白質的膠體金標記在電磁攪拌下將所需要量的蛋白質溶液，加入到相應量的膠體金溶液中，15min後加入5%牛血清白蛋白（BSA），將pH調至所需值，使其終濃度為1%，也可加入3%PEG20000使其終濃度為0.05%。
多種蛋白質、葡聚糖、PEG20000、明膠等均為良好的高分子穩定劑，PEG和BSA是最常用的穩定劑。穩定劑的作用：一為保護膠體金的穩定性，便於長期保存；二為防止或減少免疫金複合物的非特異性吸附反應。穩定劑的合理選擇十分重要，不適當的穩定劑有時也可導致非特異性反應。
5.膠體金標記蛋白的純化標記好的免疫金探計必須經過純化處理後才能用於細胞化學染色。純化的目的是除去未標記的蛋白質、未結合的膠體金以及標記過程中可能形成的各種聚合物。常用方法為超速離心法和凝膠過濾法。①超速離心法：根據膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。②凝膠過濾法：此法隻適用於以BSA作穩定劑的膠體金蛋白結合物的純化。對層析柱和洗脫液，以及pH和流速均有不同要求。純化的金標記蛋白質在層析過程中形成深紅色區帶，隨濃度增加紅色加深，而略呈黃色的區帶為未標記蛋白組分。
6.膠體金標記蛋白質的質量鑒定用有Formvar（聚醋酸甲基乙烯酯）膜的鎳網沾取金標蛋白溶液，空氣中幹燥後醋酸鈾負染，在透射電鏡下觀察，可見金顆粒周圍有一明顯的空暈，表示顆粒表麵吸附有蛋白質分子，並測定顆粒大小。
純化後膠體金標記蛋白是否保持很好的生物學活性，是判斷其質量好壞的主要指標，使用前必須鑒定其特異性和敏感性。常用免疫組化濾紙模型鑒定，可采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MFIGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附於載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法，並經銀顯影檢測相應的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。免疫細胞化學染色試驗可較全麵地反映免疫金探針的質量。
膠體金標記蛋白加穩定劑後，在一定濃度下，4℃條件下可保存數月；如在甘油中封裝，-70℃條件下可保存更長時間。
三、免疫膠體金技術的應用
膠體金試劑穩定，製備簡便，標記蛋白快且不影響蛋白質的生物學活性，方法敏感、特異，不需要使用放射性同位素，或有潛在致癌物質的酶顯色底物，因此免疫膠體金技術廣泛應用於各種免疫學測定。除主要應用於光鏡或電鏡的免疫組化法外，更廣泛地應用於各種液相免疫測定和固相免疫分析以及流式細胞術等。
（一）膠體金固相免疫測定法
1.斑點金免疫滲濾試驗（dotimmunogoldfiltrationassay，DIGFA）基本原理是以吸附性強的硝酸纖維素膜（NC膜）為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。20世紀90年代初發展的以膠體金為標記物的斑點金免疫滲濾試驗，又名滴金免疫測定法（簡稱滴金法）是在斑點免疫滲濾試驗基礎上，改用膠體金標記物代替酶，省去底物顯色的步驟。因此滴金法更加簡便、快速。
在NC膜的膜片中央先滴加純化的抗體，膜將其吸附。滴加在膜上的樣本液體滲濾過膜時，樣本中所含抗原被膜上抗體捕獲，無關蛋白被濾出膜片。隨後加入膠體金標記的抗體，與已被捕獲在膜上的抗原相結合。因膠體金本身呈紅色，陽性結果可見膜中央呈現紅色斑點。