Bm17的亞細胞定位用激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光。在vBm17 HA RE感染BmN細胞的24小時、48小時和72小時,采用FITC染色觀察。在感染後24小時,熒光分布在細胞核和細胞質(彩圖5111),在48小時熒光向細胞核遷移,72小時,相對於細胞質,更多的熒光被檢測出在細胞核。沒有病毒感染的細胞作為對照,對照組沒有熒光檢出。這些結果暗示了在病毒感染早期Bm17定位於細胞核和細胞質,晚期更多定位在細胞核。
第三節 Bm17缺失病毒、野生病毒和拯救病毒的構建
為了鑒定Bm17是否為病毒複製所必需,筆者構建了Bm17 的缺失病毒vBm KO和缺失後的拯救病毒vBm Rep(方法同上),所有缺失病毒和拯救病毒構建流程,並通過PCR驗證。
引物 CmU和17PR在以vBm WT為模板的反應中沒有PCR產物,以vBm KO和vBm Rep為模板有一個792 bp的條帶。引物17PF 和17PR在以vBm WT和 vBm KO為模板分別得到390 bp和1348 bp的目標條帶,以vBm Rep為模板同時得到1348 bp和390 bp的條帶。Tn7介導的轉座通過 M13引物進行驗證。
第四節 Bm17缺失病毒在BmN細胞上複製分析
在轉染後的96小時,我們獲得了高滴度的vBm17 KO、vBm Rep和vBm17 Rep病毒。然後用這些病毒以MOI=5感染複數分別感染BmN細胞。受感染的細胞會由於gfp基因的表達發出綠色熒光。在感染後12小時,熒光顯微鏡就觀察到3種病毒感染的細胞均發出熒光,且三者無明顯差異。在感染後的24小時和72小時,幾乎所有的細胞都發出綠色熒光,且三者無差異。在感染後96小時,vBm WT、vBm17 KO和vBm17 Rep感染的細胞,幾乎每一個細胞都被感染,且幾乎每一個細胞都有包涵體出現(數據沒有顯示)。
為了進一步評估Bm17在病毒複製中的作用,構建了一個病毒生長曲線進行了分析。BmN細胞被vBm17 KO、vBm WT或vBm17 Rep感染後,從12小時到96小時隨著時間的延長,BV的產生越來越多。病毒生長曲線表明從12小時到96小時這3種病毒的病毒增殖無顯著差異。這些結果表明Bm17的缺失並不影響BV的生產。
第五節 Bm17缺失病毒的基因組複製分析
qPCR被用於進一步測定Bm17的缺失對病毒DNA複製的影響,BV的產生開始於病毒感染後的14小時、15小時,且DNA的複製開始於7~9小時。用vBm17 KO、vBm WT和vBm17 Rep在MOI=5時,感染BmN細胞,在感染後12小時、24小時、48小時、72小時和96小時,提取病毒DNA,執行qPCR分析。結果表明,最早在感染後的12小時檢測到vBm WT、vBm KO和vBm Rep病毒DNA的複製。而且3個病毒無顯著差異,隨著感染時間的延長,DNA的量明顯增加,3個病毒的增殖速度一直到感染後96小時都無明顯差異。這個結果暗示了Bm17的缺失並不影響病毒基因組的複製。
vBm WT、vBm17 KO 或vBm17 Rep分別感染細胞後,在12小時、18小時、24小時、48小時、72小時、96小時提取病毒的基因組,用DpnI酶消化病毒基因組,去除轉染時轉入的bacmid,通過qPCR分析並繪製曲線。