二、重組質粒pUC US Cm DS的酶切鑒定
將US、Cm、DS片段依次連接到pUC18載體上，構建成重組質粒pUC US Cm DS。采用不同的酶切鑒定結果如圖587所示。酶切結果與預期大小完全一致，表明構建的pUC US Cm DS重組質粒完全正確。
三、Bm91缺失型病毒的構建和驗證
為了探討Bm91對於病毒繁殖是否必需，利用ET重組係統構建了Bm91缺失型病毒。為了不影響上下遊基因Bm90和Bm92的轉錄，Bm91中間的120bp片段被Cm取代，並用不同引物對進行PCR驗證。結果從左到右顯示用引物對Cm F/91 R從Bm91 KO中能擴增到1133bp大小片段，而以WT的bacmid為模板卻擴增不到；用引物對91 F/Cm R從Bm91 KO中能擴增到1143bp大小片段，而以WT的bacmid為模板卻擴增不到；用引物對91 F/91 R從Bm91 KO中能擴增到1251bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到332bp大小片段；用引物對91 F/91DS R從Bm91 KO中能擴增到1755bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到836bp大小片段,引物對91US F/Cm R從Bm91 KO中能擴增到1650bp大小片段，而以WT的bacmid為模板卻擴增不到；用引物對91US F/91 R從Bm91 KO中能擴增到1743bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到825bp大小片段；用引物對91US F/91DS R從Bm91 KO中能擴增到2262bp大小片段，而以WT的bacmid為模板擴增到1343bp大小片段。表明Bm91內部的120bp片段成功被Cm取代。
四、Bm91 KO GP、Bm91 Rep GP和WT GP的構建
以BmNPV基因組為模板，PCR擴增得到636bp的帶自身啟動子的Bm91補回型片段，並通過酶切回收後與已構建好的pFB ieGP連接。
五、Bm91 KO GP、WT GP 和Bm91 Rep GP 3種bacmid的獲得
分別用pFB ieGP轉化WT bacmid和pBm91 KO，在轉座酶作用下發生轉座得到Bm91 KO GP、WT GP，用pFB ieGP Bm91轉化pBm91 KO得到Bm 91Rep GP。通過藍白斑篩選得到白色重組子，用M13引物進行PCR驗證（圖5810）。當分別以Bm91 KO GP、WT GP為模板時，擴增得到含有gfp+polh+Cm的基因片段，以Bm91 KO GP為模板時擴增得到含有gfp+polh+Cm+Bm91補回的基因片段。
第四節 Bm91的功能分析
為了進一步分析Bm91是否對病毒的繁殖有影響，分別用Bm91 KO GP、WT GP 和Bm91 Rep GP轉染BmN細胞。在熒光顯微鏡下觀察轉染後不同時間細胞中GFP的表達情況［彩圖582（A）］。結果顯示從轉染後48小時開始觀察到綠色熒光，隨著時間的延長，熒光量增多。到96小時，視野所見充滿了熒光。3種bacmid轉染的細胞熒光量在不同時間點沒有明顯差別。分別收
集轉染上清液，再次感染BmN細胞。收集不同時間點的感染上清液，進行半數組織培養感染劑量（TCID50）分析。結果顯示這3種病毒在BmN細胞中的生長趨勢沒有明顯差別。同時，光學顯微鏡觀察這3種病毒在轉染後72小時的BmN細胞中形成的包涵體病毒粒子OBs沒有顯著差別。以上結果證明Bm91的缺失不影響有感染性的病毒粒子的產生。