放射免疫測定方法有以下3種主要類型：
①以放射性核素標記的抗原和檢品中待測抗原與特異性抗體競爭結合的經典RIA法。②以放射性核素標記的過量抗體與檢品中待測抗原直接結合，然後用固相抗原免疫吸附劑分離遊離標記抗體的免疫放射測定。③以放射性核素標記的配基（如激素）與細胞膜表麵或組織中的相應受體特異結合，進行測定的放射受體分析。
一、放射性核素標記
（一）基本原理
RIA是基於放射性標記的抗原和非標記待測抗原同時與限量的特異抗體進行競爭結合反應，通過分離未結合的標記抗原，測定標記抗原與抗體複合物放射強度信號，經相應的數學函數關係推算待測抗原的含量。反應式如下：
Ag*+Ag+Ab→Ag*-Ab+Ag-Ab+Ag*
Ag*：標記抗原（反應後為遊離的未結合標記抗原）
Ag：未標記待測抗原
Ab：競爭結合的有限量抗體
Ag*-Ab：標記的抗原抗體複合物
Ag-Ab：未抗記的抗原抗體複合物
反應中Ag*和Ag理化性質相同，並且兩者與Ab同在一個反應體係中，形成Ag*-Ab複合物的量（B）隨著待測抗原Ag的量增加而減少，遊離未結合的Ag的量（F）隨Ag的增加而增加；因此測定Ag*-Ab或Ag*的量即可推算出待測物的含量。這一反應稱“競爭結合反應”。
（二）實驗方法
在放射免疫分析方法中，常用的核素包括3H、125I、131I、14C和32P等。3H是弱β衰變，能量弱，易於防護，由於其衰變周期長，因而在一次標記後可在較長時間內使用，但其缺點是標記條件高，需在真空條件下標記，並需要一定的設備。其中以125I最為常用。因其具有以下優點：①125I的化學性質活潑，容易標記成功，可以用較簡便的方法標記抗原或抗體；②衰變過程中不產生β射線，對標記蛋白、多肽等抗原的免疫活性無顯著影響；③容易獲得高比放性的標記物，測定的靈敏度較高；④釋放的γ射線可用晶體閃爍計數儀直接測量，方法簡便，易於推廣應用；⑤與131I相比，125I的核素豐度、計數率及半衰期（125I的T1/2=60d，131I的T1/2為8.1d）均優於131I。3H、14C的標記方法較複雜，且液體閃爍測量不易在一般實驗室推廣。
用放射性核素標記的物質有兩類：一類是肽類、蛋白質和酶。該類物質可以用125I直接標記，即直接將125I連接到被標記分子的酪氨酸殘基的羥苯基上。另一類是甾體類化合物、環核苷酸、前列腺素等小分子化合物。由於該類物質缺乏可供核素標記的部分，因而多用間接標記法，即先將核素標記在配位體上，再連接到待標記的分子上。
1.蛋白質、多肽的放射性核素（125I）的標記
1）氯胺T法（ch-T法）：具體反應原理尚不清楚，僅僅是建立在實驗基礎上，有的學者認為當氯肽T溶於水後釋放出次氯酸，將*Iˉ離子氧化成和*I2和*I+，在pH7.0～8.0條件下與蛋白質酪氨酸殘基上鄰位氫原子發生置換反應，形成放射性碘標記化合物，用偏重亞硫酸鈉終止氧化反應，經過分離純化，獲得純的標記化合物。
【材料及試劑】
（1）0.05mol/L和0.1mol/L，pH7.4磷酸緩衝液（PB）。
（2）氯胺T溶液：用0.5mol/L，pH7.4 PB配製1mg/ml，新鮮配製，即配即用。
（3）偏重亞硫酸鈉溶液：用0.05mol/L pH7.4 PB配製成2mg/ml，新鮮配製。
（4）KI溶液：用0.05mol/L pH7.4 PB配製成2mg/ml。
（5）待標記的蛋白質或多肽：用0.05mol/L pH7.4 PB配製成1mg/ml。
（6）Na125I溶液（3.7GBq/ml）。
（7）分離柱和Sephadex G 50凝膠。
（8）0.05mol/L pH7.4磷酸鹽緩衝液（PBS）。
（9）放射性薄層掃描儀和活度計。
【操作步驟】
（1）取50μl 0.1mol/L，pH7.4 PB，加入有蓋反應瓶；
（2）加入待標記的蛋白質或多肽5μl；
（3）加入Na125I溶液5μl；
（4）加入氯胺T溶液20～150μl，反應2分鍾；
（5）加入偏重亞硫酸鈉溶液20～50μl，反應1分鍾；
（6）加入2%的KI溶液，稀釋殘留的碘化物；
（7）取少量反應液，點在Whatman 1＃紙上；
（8）在正丁醇：乙醇：氨水=5：1：2係統中進行層析，晾幹後，在放射性薄層掃描儀上測量3個峰，並計算碘利用率。
（9）將反應液過Sephadex G 50柱（Sephadex G 50柱製備：取1g Sephadex G 50在0.05mol/L pH7.4 PBS中浸泡24h以上，其間多次輕輕搖動漂去細小顆粒，待其充分膨脹後，抽氣減壓約30分鍾，排出其中氣泡；然後將凝膠加入玻璃層析管中，使其自然下降）。柱預先用0.05mol/L pH7.4PBS平衡，在用BSA20mg（溶於1ml 0.05mol/L，pH7.4PBS中）過柱，使柱飽和，用20ml 0.05mol/L pH7.4PBS清洗後即可上樣，洗脫後，收集洗脫液2ml/瓶。
（10）分別在活度計上測量並繪製曲線，合並蛋白峰，加入適量BSA和NaN3，分裝凍存或冷凍幹燥。
【質量鑒定】
（1）碘利用率（%）=C1÷（C1+C2+C3）×100%。
（2）免疫活性（%）=C0÷Ct×100%。
（3）比活度（Bq/μg）=A÷m。
式中，C1，C2，C3分別為峰1，峰2，峰3的放射性計數率（cpm）；C0是用10倍的零標準抗體與標記抗原後複合物的放射性計數率；Ct為每管加入的標記的抗原總放射性計數率；A為放射性活度，是標記時加入的放射性碘的活度乘以碘利用率；m為蛋白質的化學量。
【注意事項】
（1）應嚴格控製反應溫度、時間、體積和反應體係pH。
（2）125I用量：125I用量直接影響標記物的比活度，要根據所需的標記物的比活度和碘利用率，預先計算出125I用量。
（3）氯胺T用量：應通過預實驗來確定氯胺T的用量。用量過高，雖然可以提高碘化率，但容易損傷標記物的免疫活性；用量過低，則標記比活度低。
乳過氧化物酶（LPO）法：乳過氧化物酶法是1960年Marchalonis為標記免疫球蛋白建立的，後來用於標記一些容易失活的小分子多肽類化合物。由於乳過氧化物酶與過氧化氫首先形成絡合物，將放射性負離子氧化成碘分子，在乳過氧化物酶的催化下，將蛋白質碘化。用該方法標記的化合物時，因其整個標記過程十分溫和，不僅可以達到高比活度，而且又能保持抗原或抗體等待標記物的生物活性和免疫活性。乳過氧化物酶壽命很短，一經稀釋就停止反應，故又可以嚴格地控製蛋白質上標記碘原的數量。
【材料及試劑】
（1）乳過氧化物酶溶液：用0.05mol/L pH7.4PBS配製成12μmol/L。