（2）特異性強，背景染色淡：由於敏感性高，第1抗體和第2抗體都可被稀釋至可能的濃度，減少了非特異染色。
（3）方法簡便，需時較短：由於其敏感性高，操作抗原抗體反應的時間可由PAP法所需的2天縮短至2小時左右。
（4）由於生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結合的能力，可用於雙重或多重免疫染色。
ABC法實驗注意事項
（1）內源性生物素活性及其消除：某些組織和細胞內存在著內源性生物素，在應用該染色方法時會與抗生物素結合而產生非特異性染色。因此，對抗生物素結合性較高的組織（如肝、腎、白細胞、脂肪組織、乳腺等），在進行ABC法染色前應預先以0.01％的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20分鍾，以消除其內源性抗生物素結合活性，每次作用後用PBS洗5分鍾。必要時，也可用0.3% H2O2-甲醇液孵育以消除內源性過氧化物酶活性。
（2）生物素製劑之間相互親和性差異很大，因此在應用ABC試劑時，應注意廠家批號，對購進試劑應進行事先預測，以保證實驗結果的穩定性。
（3）ABC試劑保存溫度以4℃為佳，而在20℃生物活性在短期內即被破壞。
六、光鏡免疫金-銀細胞組織化學技術
（一）光鏡免疫金技術
Geoghegan等於1978年首次應用免疫金探針檢測B淋巴細胞表麵抗原建立了光鏡水平的免疫金法（IGS）。IGS的特點是染色程序簡便，不用顯色就能檢測細胞表麵的抗原，又能檢測細胞內抗原。IGS的標本經染色後，可在光鏡下直接觀察到由膠體金探針所示的抗原部位呈紅色。染色時，一般要求金顆粒大小為20nm。具體方法有間接法與PAG法，下麵重點介紹間接免疫金法。
間接免疫金法具體操作步驟如下：
（1）切片脫蠟，梯度酒精下行入水；
（2）0.05M TBS，pH7.4，10分鍾；
（3）1%卵蛋白（1：5正常羊血清）15分鍾；
（4）適當稀釋的1抗，37℃ 1小時或4℃ 24小時；
（5）0.05M TBS，pH7.4，15分鍾×3；
（6）0.02M TBS，pH7.4（8.2），15分鍾；
（7）1％卵蛋白（1：5正常羊血清）15分鍾；
（8）適當稀釋的金標A蛋白（金標Ⅱ抗）37℃，1小時；
（9）0.02M TBS，pH7.4（8.2），15分鍾；
（10）0.05M TBS，pH7.4，15分鍾×3；
（11）雙蒸水，5分鍾×3；
（12）為加強對比度，可用蘇木精液複染；
（13）常規脫水、透明、封固。
結果：陽性部位呈紅色或深紅色。
注意：①在第6步和第9步括號中的數值係用金標Ⅱ抗時的封閉血清及緩衝液的pH值。②在第5步、第10步以及第11步驟中的”×3“是指要求換洗3次。
（二）免疫金-銀法
1983年Holgate等人將IGS與銀顯影方法相結合，創立了免疫金-銀法（IGSS）。IGSS的基本原理是通過免疫反應沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑的作用，用對苯二酚還原劑將銀離子（Ag+）還原成銀原子（Ag）。被還原的銀原子圍繞純金顆粒形成一個“銀殼”，形成的“銀殼”具有催化作用，使更多銀離子還原，促成“銀殼”越變越大，最終抗原位置得到清楚放大。
IGSS間接法具體染色步驟如下（以肝細胞HBsAg定位為例）：
（1）切片常規脫蠟至水，1％硫代硫酸鈉水溶液脫碘5分鍾；
（2）雙蒸水衝洗後，以0.05mol/L TBS pH7.4洗滌5分鍾×2次，用0.1％胰蛋白酶消化10分鍾或3mol/L尿素酶消化20分鍾；
（3）0.05mol/L TBS洗5分鍾，以1％卵白蛋白封閉15分鍾；
（4）以馬抗HBsAg抗體（1：1000）孵育1～2小時（37℃）或4℃過夜；
（5）以0.05mol/L TBS洗5分鍾×2次，再以1％卵白蛋白封閉10分鍾；
（6）以PAG 37℃孵育45分鍾；
（7）0.05mol/L TBS洗5分鍾×2次，雙蒸水振洗5分鍾×2次，入銀顯影液，暗室內顯影至合理強度；
（8）雙蒸水5分鍾×2次，蘇木素襯染，脫水，透明，封固，觀察。
結果：陽性結果為肝細胞細胞質內有膜形或包含體形分布的黑色顆粒，背景幹淨。作冷凍切片的組織，若在動物實驗可以先經過固定液灌注固定或浸泡固定，也可不固定先做冷凍切片。人體組織也可通過浸泡固定或不固定，這主要根據保存抗原性的需要而定。固定過的組織可用含20％蔗糖的PBS（0.01mol/L pH7.2）浸泡2～4小時，或在切片時用OCT包埋，以減少冷凍過程冰晶的形成。如果切片還準備用於電鏡包埋，則可經過5％、10％、20％濃度逐級遞增的蔗糖溶液。在行冷凍切片前，可先入氟利昂（Feron-22）驟冷，這樣可使組織結構保存更好，適用於電鏡觀察。冷凍切片、染色步驟同上。
（林燕萍）