五、親和組織化學技術
自20世紀70年代以來，一些具有雙價或多價結合力的物質，如植物凝集素、生物素和葡萄球菌A蛋白（SPA）等被應用於免疫細胞組織化學技術，建立了如ABC法、LAB法、BAB法、SPA-HRP法、凝集素法等。這些方法的共同特點是以一種物質對某種組織成分具有高度親和力為基礎。1976年Bayer等首次稱之為親和組織化學。親和組織化學引入免疫細胞化學後使免疫細胞化學技術又得到了很大進展，進一步提高了該種技術的穩定性和靈敏度，為檢測微量抗原、受體或抗體開辟了一條新的研究途徑，更有利於微量抗原（抗體）在細胞或亞細胞水平的定位。
親和素（avidin）又稱為卵白素，是由卵蛋白中提出的一種糖蛋白，分子量為68000。生物素（biotin）是由卵黃或肝中提出的一種維生素（維生素H），分子量更小，僅為24431。每個親和素分子上有4個與生物素結合的位點，二者間的親和力比抗原和抗體間的親和力大100萬倍。親和素和生物素可形成牢固的、不可逆的結合。下麵主要介紹常用的LAB法、BAB法和ABC法。
（一）標記親和素-生物素法（LAB法）
標記親和素-生物素（LAB）法是將標記物辣根過氧化物酶與親和素結合，一個親和素分子可以偶聯或吸附多個酶分子。生物素與抗體（1抗或2抗）結合，一個抗體分子可以結合多個生物素分子，而其免疫活性不受影響。染色的主要步驟是先使抗原與生物素化的抗體結合，再使酶標的親和素與結合在抗體上麵的生物素結合，經酶顯色定位和檢測標本內的抗原成分。染色具體方法如下：
（1）切片或塗片固定後在PBS中漂洗；
（2）滴加含有25～50μg/ml生物素標記的抗體（1抗或2抗）溶液，置濕盒中室溫下孵育1小時；
（3）棄去作用液，以PBS漂洗2次；
（4）滴加20～50μg/ml過氧化物標記的親和素溶液，置濕盒中室溫孵育90分鍾；
（5）棄去作用液，以PBS漂洗2次；
（6）用DAB-H2O2液使酶顯色；
（7）PBS漂洗；
（8）梯度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封固，顯微鏡觀察。
（二）橋連親和素-生物素法（BAB法）
橋連親和素-生物素法（BAB法）是將生物素分別與抗體和過氧化物酶結合。其染色步驟是先以生物素化抗體與標本內的抗原結合或與標本內的抗體Ⅱ結合，再以遊離的親和素將生物素化抗體和酶標的生物素橋連起來，達到多層放大，從而定位標本中的抗原成分。具體染色方法如下：
（1）切片或塗片固定後以PBS漂洗；
（2）滴加第1抗體，置濕盒中室溫孵育1小時；
（3）棄去作用液，以PBS漂洗2次；
（4）滴加生物素標記的第2抗體，置濕盒中室溫孵育90分鍾；
（5）棄去作用液，以PBS漂洗2次；
（6）滴加一定濃度的遊離親合素，置濕盒中室溫孵育1小時；
（7）棄去作用液，以PBS漂洗2次；
（8）滴加生物素標記的酶，置濕盒中室溫中作用1小時；
（9）棄去作用液，以PBS漂洗2次；
（10）用DAB-H2O2液使酶顯色；
（11）用PBS漂洗；
（12）梯度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封固，顯微鏡觀察。
（三）親和素-生物素-過氧化物酶複合物法（ABC法）
ABC法是美籍華人Hsu等於1981年在BAB法和LAB法的基礎上改良的，其特點是利用抗生物素分別連接生物素標記的第Ⅱ抗體和生物素標記的酶。其第1抗體不為標記物所標記，生物素標記的第Ⅱ抗體與ABC複合物相連接。ABC複合物是將過氧化酶結合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應而製備的。具體操作步驟如下：
（1）細胞塗片、冷凍切片
風幹後用丙酮固定5～10分鍾，然後用0.3%的H2O2-甲醇溶液室溫處理25～30分鍾，或3%H2O2-甲醇溶液處理5分鍾，以阻斷內源性過氧化物酶。石蠟切片常規脫蠟，複水。以此方法消除內源性過氧化物酶後，根據需要酌情使用蛋白酶消化，或行微波抗原修複以便充分暴露抗原物質；
（2）PBS衝洗後，1%小牛血清或正常羊血清（1：20～1：50）室溫下處理20分鍾；
（3）移去多餘液體後，滴加適當稀釋的第Ⅰ抗體，置於濕盒中室溫孵育30～60分鍾，或4℃過夜；
（4）PBS衝洗後，滴加生物素化的第Ⅱ抗體，置於濕盒中室溫孵育30分鍾（或37℃）；
（5）PBS衝洗後，滴加ABC複合物試液，室溫濕盒孵育30分鍾（或37℃）；
（6）PBS衝洗後，以0.05％DAB Tris-HCl（0.05mol/L，pH7.6）平衡切片（即預加不含H2O2的0.05％DAB-Tris-HCl），使切片適於顯色條件；
（7）移去多餘液體，以新鮮配製的0.05%DAB-0.01%H2O2顯色，室溫1～10分鍾，鏡下控製顯色；
（8）PBS衝洗後，以蘇木精或甲基綠複染，脫水，封固，顯微鏡下觀察。
ABC法具有以下特點：
（1）敏感性強：ABC法與PAP法相比，發現其敏感性較PAP法高20～40倍，能顯示PAP法所不能顯示的抗原。