（二）酶標抗體法具體染色方法
酶標抗體與熒光素標記抗體的染色方法基本相同，亦分直接法和間接法。直接法就是將酶直接標記在第1抗體上，間接法是將酶標記在第2抗體上。染色時間和過程與免疫熒光基本類似，所不同的是用酶標記抗體與抗原結合後，需再滴加酶的底物H2O2和供氫體二氨基聯苯胺（DAB）。酶和底物反應後可產生有色沉澱物，借助一般光學顯微鏡（或電子顯微鏡）即可進行觀察，同時，此種標本可永久保存。
酶標抗體間接染色法具體步驟如下：
（1）切片準備：石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇複水至PBS；固定組織冷凍切片，新鮮組織恒冷切片經丙酮固定後直接入PBS；
（2）以0.3%H2O2-甲醇液處理30分鍾，封閉內源性過氧化物酶（石蠟切片可省略）；
（3）PBS洗滌後，0.2%～1%Triton-X 100 37℃處理30分鍾；
（4）1：20～1：30正常羊血清室溫處理30分鍾；
（5）以1％牛血清白蛋白稀釋的適當濃度的1抗孵育37℃ 60分鍾，或4℃ 24小時；
（6）PBS洗滌後，以HRP標記的第2抗體孵育1小時（室溫）或30分鍾（37℃）；
（7）PBS充分漂洗後，以0.01％H2O2～0.05％DAB顯色（顯色液應新鮮配置）；
（8）經PBS漂洗3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，明膠甘油封閉，顯微觀察。
結果：抗原抗體結合部位顯棕色。
注意：實驗時需進行免疫學對照染色。
優點：與免疫熒光技術相比，該法終產物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，反複觀察，適合於鏡下半定量分析，DAB終產物具有嗜鋨酸性，經鋨酸處理後，電子密度增強，可用於電鏡觀察。
（三）非標記抗體酶法
1.酶橋法酶橋法具體步驟如下：
（1）切片準備及第1抗體孵育前處理同間接法，第1抗體（假設來自種屬A）孵育24小時（4℃）。第1抗體的稀釋度可大些，使抗體的兩個Fab段均與組織抗原結合，較牢固，漂洗時不易丟失；
（2）切片與第Ⅱ抗體（即橋抗體，抗種屬A IgG抗體）孵育1～1.5小時（室溫）。應用過量的橋抗體能保證一個Fab段與第Ⅰ抗體結合，另一個Fab段遊離；
（3）切片與抗酶抗體（來自種屬A）孵育1～1.5小時（室溫）。因抗酶抗體與第Ⅰ抗體均係種屬AIgG，具有相同的抗原性，所以橋抗體遊離的Fab能與抗酶抗體結合，起橋作用。將其連在與組織抗原結合的Ⅰ抗上；
（4）切片與酶（HRP 70～100μg/ml，PBS溶解）孵育30分鍾（室溫）使酶與抗體結合；
（5）顯色、封固等均與酶標抗體法相同。
2.過氧化物酶-抗過氧化物酶複合物法（PAP法）
過氧化物酶-抗過氧化物酶複合物法簡稱PAP法，是由Sternberger（1970年）首先報道的。該法的建立是免疫細胞化學技術的一重大發展。PAP法中需要3種抗體，第1抗體（抗體1）、第2抗體（抗體2）和抗酶抗體。其中關鍵的試劑是抗酶抗體複合物即PAP複合物。PAP複合物是以辣根過氧化物酶作為抗原，免疫動物，使之產生抗酶抗體。所應用的動物種類應和製備第1抗體的動物相同。抗酶抗體在應用前先和足量的酶結合，製備成由3個酶分子和兩個抗酶抗體分子組成的非常穩定的環形PAP複合物（有成品出售）。PAP染色的方法和免疫酶標技術基本相同。染色時所應用的抗體順序為特異性第1抗體，使其與標本內的抗原結合，其次為第2抗體（亦稱橋抗體），第3為PAP複合物。
由於標本內的抗原可層層放大，可結合多個酶分子，因此，PAP法敏感性極強，現已廣泛應用於科研工作和病理學診斷。具體染色方法如下：
（1）標本經固定（石蠟切片需經脫蠟，梯度乙醇至水化）後用PBS漂洗；
（2）0.3％H2O2-甲醇溶液封閉內源性過氧化物酶10～30分鍾（室溫）；
（3）PBS漂洗後，以1%牛血清白蛋白或1：30～1：50正常羊血清孵育15～30分鍾；
（4）吸去多餘液體後，滴加適當濃度的第1抗體，4℃濕盒內孵育過夜（18小時）；
（5）PBS充分漂洗後，滴加適當濃度的第2抗體室溫孵育1小時或37℃30分鍾；
（6）PBS漂洗後，滴加適當濃度的PAP複合物孵育1～3小時（室溫）；
（7）PBS漂洗後，以0.05% DAB-Tris-HCl（0.05mol/L，pH7.6）平衡切片，使切片適於顯色條件；
（8）以新鮮配置的0.05％DAB-0.1% H2O2-0.05mol/L，Tris-HCl（pH7.6）顯色，室溫1～10分鍾，鏡下控製反應程度，適時終止顯色；
（9）PBS漂洗後，以蘇木精液輕度複染；
（10）梯度乙醇脫水，二甲苯透明，明膠封固，顯微鏡下觀察。
PAP法比直接法、間接法、酶橋法更敏感，特別適用於石蠟切片中微量抗原和抗原性減弱抗原的檢測。但PAP法操作步驟較為繁瑣，花費時間較長，因此不適用於臨床常規檢查。PAP法目前主要用於腫瘤的鑒別診斷，特別是對低分化癌和轉移性腫瘤。由於通常用於石蠟切片，故可用於回顧性研究。