第三節 結締組織常用的染色
一、蘇木精－伊紅（HE）染色
此法是染製一般組織和病理組織的基本方法，是學習組織切片的入門。
染色步驟：
（1）按常規石蠟切片法裱好的切片，經二甲苯脫蠟後，下行至蒸餾水中待染。
（2）在蘇木精染液中染10~30分鍾，如是Zenker液固定的組織，染色時間應加長。常用的蘇木精染液的配製方法有Mayer、Ehrlich等。
（3）將組織切片從染液中取出，用自來水洗去多餘染液。
（4）分色：將切片入含0.5%鹽酸的70%酒精中，分色時應在鏡下檢查，至核呈紫紅色，細胞質無色為適宜。不同的組織染色時間及在鹽酸酒精中的分色時間並不完全相同，通過大量操作即可掌握。分色液中鹽酸的濃度可以在0.1%~0.5%範圍內選擇。
（5）將已分色的組織切片入自來水中衝洗或加數滴純氨水堿化，待細胞核變成藍色即可。
（6）將切片入蒸餾水中衝洗，去掉堿性物質。否則對伊紅染色不利。
（7）複染：切片入1%伊紅水溶液中10~30分鍾。
（8）水洗：將切片入蒸餾水中洗去多餘伊紅染液。
（9）脫水：切片依次在70%、80%、95%、100%各度酒精中進行，低度酒精稍微快一些，不然伊紅易褪掉。至95%酒精後對伊紅分色，在顯微鏡下胞質和結締組織纖維呈桃紅色。最後入無水酒精中。
（10）透明、封固：切片入二甲苯2次，用中性樹脂進行封固。
染色結果：細胞核呈藍至深藍色，核外染色質呈藍色，透明軟骨基質呈藍或藍紫色。細胞質、膠原纖維、肌纖維及嗜酸性顆粒呈粉紅色或淺紅色，兩色對比鮮明。脫鈣骨基質呈粉紅色。
蘇木精染液的配製：蘇木精（Hematoxylin）又稱蘇木精或蘇木紫，是自一種從蘇木精樹中提煉出來的。提煉出的粉末呈淡黃色或淺棕色，在陽光或空氣中擱久則變紅，易溶於酒精或甘油中。未經氧化的蘇木精並無染色能力，隻有氧化成蘇木紅才具有染色能力。蘇木精的氧化有兩種方式，一是自然氧化，另一種是加入氧化劑，一般均采取自然氧化，其結果要比加氧化劑的要好。配方有多種，常用的有：
1）Ehrlich蘇木精：蘇木精2g，無水酒精100ml，蒸餾水100ml，鉀明礬3g，冰醋酸10ml。蘇木精用酒精溶解後，依次加入其他試劑，混合後呈淺紅色。用數層紗布蓋好瓶口，置日光充足處，經6~8周即配製好，此時為紫紅色，可長期保存。
2）Harris蘇木精：蘇木精1g，無水酒精10ml，蒸餾水200ml，鉀（或銨）明礬20g，冰醋酸8ml，氧化汞0.5g。將蘇木精溶於酒精，明礬溶於蒸餾水，加熱助溶。二者在燒杯內混合，加熱煮沸，離開火後緩慢加入氧化汞並用玻棒攪動，再加熱片刻，將燒杯立即置於冷水中冷卻。次日過濾，加入冰醋酸，再過濾即可應用。此染液用於染甲醛溶液或Zenker液固定的組織，頗為理想。
3）Mayer蘇木精：蘇木精1g，蒸餾水100ml，鉀明礬50g，碘酸鈉0.2g，枸櫞酸1g，水合氯醛50g。將蘇木精、明礬、碘酸鈉、蒸餾水混合，加熱助溶，再加枸櫞酸及水合氯醛，在燒杯內混合，加熱煮沸5分鍾。冷卻、過濾。放置過夜即可應用。
伊紅染液（0.5%～1%伊紅水溶液）的配製：伊紅Y 0.5~1g，蒸餾水100ml。
二、膠原纖維染色
新鮮膠原纖維呈白色、成束較粗。其間可見其分支互相交織，纖維束周圍即基質。膠原纖維易被酸性染料染色。
（一）Heidenhain“Azan”染色
此法對顯示膠原纖維及細胞內的特殊顆粒均有良好效果。由於細胞顆粒的性質不同，可染成不同的顏色，如紅色、黃色、藍色等。此外顏色鮮豔，還能久存。
染色步驟：
（1）組織最好用含有升汞的混合液固定，如Susa混合液、Stieve液、Zenker液、Helly液等。用甲醛、Carnoy液、Bouin液固定的組織染色不佳。
（2）石蠟切片5~7μm。
（3）切片脫蠟，經各度酒精至蒸餾水洗。
（4）於56～60℃入偶氮卡紅G溶液染45～60分鍾，從溫箱取出於室溫再染5～10分鍾。染色前將染液放在溫箱內，待染液的溫度為56～60℃時，入切片染色，必須蓋緊染色缸。
染液的配製：偶氮卡紅G 0.1g加蒸餾水100ml，加溫煮沸片刻，冷後過濾，於100ml濾液內加冰醋酸1ml。此液在室溫保存時，可出現大量極細的針狀結晶，結晶若不溶解則無染色能力。故染前需加溫使結晶溶解，成透明液體後才利於染色。
若無偶氮卡紅G，可用偶氮卡紅B代替，其量增至0.25～1g。
（5）蒸餾水洗，入含0.1％苯胺油的95％酒精鑒別，至細胞核呈鮮明紅色、細胞質及結締組織褪色為止。若脫色過慢，可改用0.1％苯胺油水溶液，以減短脫色時間。
（6）入含1%冰醋酸的95％酒精，洗去苯胺油，約1～2分鍾，若紅色過深再用苯胺油脫色。
（7）入5％磷鎢酸水溶液1～3小時，切片於此液中可繼續脫去其他組織的顏色，並有媒染下液的作用。
（8）蒸餾水速洗，入下液染1～3小時。
染液的配製：苯胺藍（水溶性）0.5g，橘黃G 2g，蒸餾水100ml，冰醋酸8ml混合後加溫煮沸，冷後濾過，用時以蒸餾水稀釋1～3倍。
（9）蒸餾水洗，以95％酒精鑒別，至微細的膠原纖維呈深藍為度。
（10）經無水酒精脫水，二甲苯透明，封固。
結果：膠原纖維呈深藍色。核呈深紅色，細胞質呈粉紅色，肌纖維依固定液的不同染成紅色或橘黃色，類膠體及黏蛋白呈藍色，神經膠質呈紅色，細胞質的顆粒依其性質不同而染成紅色、藍色或黃色。
（二）AZAN改變法
染色步驟：
（1）取材，固定，切片同前法。
（2）按前法偶氮卡紅染色至苯胺酒精分色（即前法的1~5步驟）後，入地衣紅染液染8~12小時。
染液的配製：地衣紅1g，濃鹽酸1ml，80％酒精100ml。溶後過濾使用。
（3）水漂洗後入0.5%磷鎢酸液5分鍾。
（4）苯胺藍-橘黃G液染1小時以上。
（5）以下同前法。
結果：膠原纖維呈藍色，彈性纖維亮呈紅色，肌纖維呈紅色，紅細胞呈橘紅色。
注：偶氮卡紅染液可用1%酸性複紅或0.5％熒光桃紅代替，結果與改變法一致。
（三）Mallory三色法
染色步驟：
（1）固定：以含升汞的固定劑為首選。如Helly、Zenker等，Bouin液也可。
（2）切片常規下行入水。
（3）在0.5%酸性複紅水溶液染色1分鍾。
（4）蒸餾水漂洗後，入染液染色1~2小時。
染液的配製：苯胺藍0.5g，橘黃G 2g，磷鉬酸或磷鎢酸1g，蒸餾水100ml。
（5）蒸餾水漂洗後，在95%酒精分色。
（6）脫水，透明，封固。
結果：膠原纖維呈藍色。軟骨基質呈藍色，肌纖維呈紅色。紅細胞呈橘黃色，核呈紅色。