4.灌濃縮膠
配製濃縮膠，配製好後加入30μL AP溶液和8μL TEMED，混合後立即加到分離膠上層，插入預先選擇好的樣品梳（10或15孔，1或1.5mm厚），注意不要帶入氣泡。
（三）電泳
1.樣品提取液處理
取20μL樣品提取液，置於1.5mL離心管中，再加入等體積的樣品緩衝液，混合後於100℃沸水浴中煮沸5min，然後於10000×g離心5min以除去加熱過程中沉澱的蛋白質，收集上清液，即為樣品液。
2.上樣
取下樣品梳（注意不要拉斷樣槽隔牆）並抽出夾條，將製好的凝膠板夾在電泳槽上並向內外槽注入稀釋10倍的電極緩衝液。用移液器針頭或上樣槍頭吸取樣品液，插入樣品槽下部慢慢進樣，每槽點樣10～50μL（根據具體情況不同），但在利用等體積上樣法時，各上樣槽應保證相同的樣品體積。
3.電泳
紅線接電源正極，黑線接電源負極，將電泳儀電壓調至75V，電泳至溴酚藍標誌到達濃縮膠與分離膠交界處並成一條細直線時，調整電壓至150V進行電泳，直至溴酚藍標誌到達凝膠前沿為止，停止電泳並切斷電源。
電泳結束後，取下玻璃板，用刀輕輕從板側縫間撬開玻璃板（注意切忌從凹槽處撬），取出凝膠，並標記好左右順序。
4.固定
取出電泳膠片後，放在200g/L三氯乙酸溶液中浸泡30min，以固定蛋白質。
5.染色
再將凝膠膠片放入染色液中，置於搖床上搖動60min左右。
6.脫色
傾倒出染色液，用蒸餾水衝洗膠片兩遍，然後加入脫色液，置於搖床上進行脫色。若要加快脫色速度可在脫色盒子中放一塊海綿。
（四）結果保存
將脫過色的凝膠照相或掃描後保存結果，也可製作幹膠保存。幹膠製作作為實驗報告的憑證。作為學生實驗報告可用繪圖，製作方法為：裁下2張比膠片四邊長3cm左右的玻璃紙在水中浸濕後，先將一張平鋪在玻璃板上，放上凝膠片，再蓋上另一張，用玻璃棒趕走氣泡，將玻璃紙邊緣折向玻璃板底部，用另一塊同樣大小的玻璃板壓住，再用夾子夾住兩端固定，室溫下避光放置1d左右即可，然後取下幹膠，修剪整齊保存。
（五）計算相對遷移率（Rf），估算目標蛋白質的相對分子質量
根據電泳結果在膠上直接測量或在電泳圖譜上測量各蛋白質的遷移率，計算標準蛋白質、待測樣品的相對遷移率。以標準蛋白質電泳的相對遷移率為橫坐標，標準蛋白質相對分子質量的對數為縱坐標，繪製標準蛋白質的標準曲線，再根據樣品相對遷移率在曲線上求出待測樣品蛋白質亞基的相對分子質量。要得到一個可靠的結果，實驗需多次重複。
注意事項
(1)ACr和BIs是神經性毒劑，且對皮膚有刺激作用。配製貯液、配膠、灌膠操作時，要戴上醫用乳膠手套或指套，避免與皮膚接觸。隻要細心操作，一般不會引起損傷。
(2)ACr和BIs的純化
精確的定量分析和製備電泳需要純度更高的ACr和BIs，其提純方法如下：
①ACr重結晶方法：將ACr溶於50℃氯仿（70g/L）中，趁熱過濾，濾液冷卻至20℃，結晶。用冷的布氏漏鬥抽濾，收集結晶。用冷氯仿淋洗結晶，真空幹燥。純ACr的熔點為(84.5±0.3)℃。
②BIs重結晶方法：將12gBIs溶於1000mL 40～50℃的丙酮中，趁熱過濾，濾液逐漸冷卻至20℃，用冷的布氏漏鬥抽濾，收集結晶。用冷丙酮淋洗，真空幹燥。純BIs的熔點為185℃。
(3)100g/L SDS需放置在常溫下，低溫會有SDS析出。
(4)配製考馬斯亮藍R-250染色液時，先加乙醇和部分水，用磁力攪拌器充分攪拌30min，待考馬斯亮藍完全溶解後再加入乙酸，最後加水定容至500mL。
(5)若用水壓線時可能會導致分離膠靠近濃縮膠一側被水稀釋，濃度變低，呈現梯度膠。
(6)注膠時應避免帶入氣泡。
思考題
(1)電泳時，上下電泳槽產生的氣體是什麼？用過一次的電極緩衝液是否可以混合後再用？為什麼？
(2)上樣前為什麼要將樣品在沸水浴中加熱3～5min？
(3)SDS-PAGE是否需在低溫下進行？為什麼？
(4)試分別分析電泳圖譜模糊、不出現蛋白條帶，或蛋白條帶出現拖尾、邊緣效應的原因。