實驗結果與計算
1.測定數據記錄
2.計算結果
顯色反應後，分別記錄樣品管反應混合液的吸光度值（ODS）和空白對照管反應混合液的吸光度值（ODC）。根據吸光度值差值，從標準曲線上查出相應的還原型穀胱甘肽量，計算每克果蔬組織（鮮重）中還原型穀胱甘肽含量，表示為μmol/g。
注意事項
(1)在提取樣品時，需要沉澱除去蛋白質，以防止蛋白質中所含巰基及相關酶對測定結果的影響。
(2)利用本方法還可以測定樣品中總穀胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型穀胱甘肽（GSSG）含量。在穀胱甘肽還原酶（GR）作用下，將GSSG還原成GSH後再進行測定和計算。
(3)建議在第一次測定時先做2～3個樣品本底對照，如果樣品本底對照和空白對照非常接近，則說明樣品液中不存在幹擾物質，可以不再檢測樣品本底對照。如果樣品本底對照和空白對照有顯著差異，則在測定每個樣品時需做樣品本底對照。
思考題
(1)試分析調零管、空白對照管和本底對照管中測定的吸光度值分別反映了什麼意義？
(2)試分析反應液中DTNB對吸光度值和測定結果的影響，試確定測定過程中導致誤差的因素。
Ⅱ.穀胱甘肽還原酶活性的測定
目的要求
學習果蔬組織中穀胱甘肽還原酶活性的測定原理和方法。
基本原理
穀胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）是一種黃素酶，每分子酶蛋白含有一分子的黃素腺嘌呤二酸（FAD）。穀胱甘肽還原酶在許多組織中都有分布，維持細胞內充足的還原型穀胱甘肽（GSH）水平。還原型穀胱甘肽可使含巰基（—SH）的蛋白質或酶處於還原狀態或活性狀態，對於維持蛋白質或酶的正常功能、維持細胞內較高的還原勢具有很大意義。
在還原型輔酶Ⅱ［nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form)，NADPH］提供氫的條件下，GR能將氧化型穀胱甘肽（GSSG）還原成還原型穀胱甘肽（GSH），同時，NADPH形成NADP+。
NADPH在波長340nm處有吸收峰，因此可以通過測定OD340的減小來計算穀胱甘肽還原酶的活性。
材料、儀器及試劑
（一）材料
各種水果和蔬菜（如梨、馬鈴薯）。
（二）儀器及用具
研缽、高速冷凍離心機、移液器、離心管、試管、計時器、水浴鍋、容量瓶（100mL、200mL、1000mL）、紫外分光光度計。
（三）試劑
1.0.1mol/L、pH 7.5磷酸鈉緩衝液（含1mmol/L EDTA）
0.1mol/L、pH 7.5的磷酸鈉緩衝液的配製方法見附錄1。
稱取29.2mg EDTA，用0.1mmol/L、pH 7.5磷酸鈉緩衝液溶解，定容至100mL。
2.5mmol/L氧化型穀胱甘肽（GSSG）溶液
稱取20.3mg GSSG，用蒸餾水溶解、定容至10mL。配製成GSSG溶液後，適當分裝，於-20℃保存，或者4℃保存，現用現配。
3.4mmol/L NADPH溶液
稱取33mg NADPH-Na4，用蒸餾水溶解、定容至10mL。所配得溶液宜於-70℃保存。
實驗步驟
（一）酶液製備
稱取5.0g果蔬樣品置於經預冷的研缽中，加入5.0mL經4℃預冷的0.1mol/L、pH 7.5的磷酸緩衝液（含1mmol/L EDTA），冰浴研磨勻漿後，於4℃、12000×g離心30min，收集上清液用於酶活性測定。
（二）活性測定
取1支試管，依次加入2.7mL 0.1mol/L、pH 7.5的磷酸緩衝液（含1mmol/L EDTA）、0.1mL 5mmol/L GSSG溶液和0.2mL酶液。最後加入40μL 4mmol/L NADPH溶液以啟動酶促反應，立即混合，並開始計時。對分光光度計進行調零，從啟動後15s開始測定，記錄反應混合液在波長340nm處的吸光度值，每隔30s記錄一次，連續測定，至少獲得6個點的數據。實驗重複三次。