在以後一年多的時間裏，雖然劉少奇還是負責中央一線工作，但毛澤東已經不再信任他了。毛不僅提出了“赫魯曉夫現正睡在我們的身旁”這種危言聳聽的論斷，而且還不止一次地對省市黨政主要幹部提出“中央出修正主義，你們怎麼辦？”這樣的問題，並提醒他們說“很可能出，這是最危險的。”毛澤東認為劉少奇就是正睡在我們身旁的赫魯曉夫式的人物，他要重新考慮接班人，要把劉拿下來。在一些重要的事情上，他不再與劉少奇及其他常委通氣，而是在背後支持江青等極少數人做新的鬥爭準備，找人搞《評新編曆史劇〈海瑞罷官〉》的名堂，以期發動一場新的更大規模的運動。中共中央核心領導集團在形式上還維持在統一的領導集體內，但實際上的分裂已經開始了。黨內個人崇拜、個人專斷的痼疾非但沒有因劃分一二線的體製而減輕，反而更加難以溝通，而且作為一個集中統一的黨，原則性和工作性的問題到中央一層就無法回避，這更加速了權利與責任的離心力量。毛澤東最後認定劉少奇就是黨內的赫魯曉夫式的人物。
二、“文化大革命”的發動和劉少奇的被打倒
“文化大革命”開始時，劉少奇等中央一線領導人對毛澤東要開展的這場政治運動並沒有足夠的認識和思想準備。1966年5月29日，劉少奇主持召開 “文化大革命情況彙報會”，中共中央政治局主持日常工作的三位常委劉少奇、周恩來、鄧小平及有關領導人研究決定，由“中央文革小組”組長陳伯達率工作組去人民日報社，由中共河北省委書記處書記張承先率工作組去北京大學。在幾個中央領導同誌商定之後，周恩來還當場到隔壁房間用電話向正在杭州的毛澤東請示，獲得同意。
6月3日，劉少奇主持召開了常委擴大會議，彙報和討論北京地區“文化大革命”的情況。會議確定，在運動中“內外有別”，“注意保密”，“不搞大規模聲討會”，“不要包圍黑幫住宅”等八條方針。決定向北京市的一些大學、中學派出工作組，貫徹八條。
派工作組不僅是當時已經亂起來的客觀形式所迫，也是黨領導運動的傳統方法，而且還有毛澤東批準派工作組到人民日報和北京大學的先例可援。劉少奇力求把運動納入黨領導的軌道，支持工作組領導運動。6月20日，劉少奇批發了北大工作組處理5月18日亂批亂鬥“牛鬼蛇神”事件的簡報，要求各單位參照北大工作組的辦法，處理類似事件。 劉少奇還批轉了一些地方給中央的有關“假左派”鬧事的報告。根據這些指示精神，北京市開展了“反幹擾”運動，各地也對反工作組事件進行了程度不同的處理，反工作組的激進學生受到打擊，有些甚至被審查批判。盡管這種處理方式有些簡單生硬，局勢終究是平穩下來了。但毛澤東的思路是“天下大亂，達到天下大治”，要充分發動群眾起來“革命”。劉少奇的做法，自然引起了他的不滿。
7月18日，毛澤東從武漢回到北京，首先聽取陳伯達、江青等人關於工作組的彙報。7月24日，25日，毛澤東召集中央常委和“中央文革小組”成員開會，指責工作組“起壞作用，阻礙運動”，批評了劉少奇、鄧小平，作出了撤銷工作組的決定。這使劉少奇等中央一線領導陷入極為難堪的境地。7月29日，劉少奇在北京市大專院校和中等學校“文化大革命”積極分子大會上的講話，表示了這種無所適從的心境。他說：“文化大革命怎麼革，你們不曉得來問我，我老實回答你們，誠心回答你們，我也不曉得，我想黨中央其他許多同誌，也是不曉得。”“現在隻能講一句話，放手發動群眾”。
為了弄清“文化大革命”究竟怎樣搞，響應毛澤東要求高級幹部親自參加北京各學校的運動的號召，劉少奇於8月1日至4日親自來到北京建工學院蹲點。
8月1日，根據毛澤東提議，八屆十一中全會召開。8月4日，毛澤東在常委擴大會議上講話，極其嚴厲地指責派工作組是犯了“鎮壓”群眾的“路線錯誤”。劉少奇就工作組問題主動承擔責任，毛澤東接過話頭說：“你在北京專政嘛，專得好！”當葉劍英講到我們有幾百萬軍隊，不怕什麼牛鬼蛇神時，毛澤東聲色俱厲地說：“牛鬼蛇神，在座的就有！”8月7日，毛澤東寫的《炮打司令部》的大字報印發大會，更嚴厲地批評“從中央到地方的某些領導同誌”，“站在反動的資產階級立場上，實行資產階級專政，將無產階級轟轟烈烈的文化大革命打下去”，並把工作組問題同1962年、1964年中央工作指導方針上的分歧聯係起來，明確指出黨中央內部有個“資產階級司令部”，否定了以劉少奇為代表的中央一線領導。劉少奇這才意識到自己“犯了嚴重錯誤”。從8月8日下午開始，會議轉入討論毛澤東的大字報，批評矛頭指向劉少奇、鄧小平。這次全會改選了中央領導機構，劉少奇從第2位下降到第8位，實際上已經靠邊站了。他不再參與中央的日常工作，不再過問“文化大革命”的事情，開始閉門思過，按毛澤東的《炮打司令部》大字報的調子寫檢查。毛澤東《炮打司令部》的大字報通過各種非正式渠道很快流傳到社會上，不久即出現針對劉少奇的大字報。
撤銷工作組以後，“文化大革命”進入革命造反的激進時期，劉少奇及其派工作組問題被作為一條壓製革命的“資產階級反動路線”。10月9日至28日，毛澤東主持召開了以“批判資產階級反動路線”為主題的中央工作會議。陳伯達、林彪先後作長篇講話，點名批判劉少奇、鄧小平“執行了資產階級反動路線”。他倆的講話得到毛澤東的批準，大量印發到群眾之中。會上一些人指名道姓地批判劉、鄧，調子越來越高。10月23日，劉少奇、鄧小平在全體會議上作檢查。劉少奇的檢查有三方麵的內容。首先，他講了工作組50多天的情況，表示要負主要責任。其次，他講了曆史上犯了“一些原則性和路線性的錯誤”的情況，著重講1962年和1964年的事情。再次，他檢討了自己犯錯誤的原因是不理解運動，怕亂，錯誤估計當時運動的形勢，思想上還存在許多唯心和形而上學的觀點，最根本的是沒有學好和掌握好毛澤東思想。劉少奇在檢討中不得不違心地承擔了許多責任。毛澤東事先早就看過劉少奇檢查的初稿。9月14日，他在初稿上批示：“少奇同誌：基本上寫得很好，很嚴肅，特別是後半段更好。建議以草案形式印發政治局、書記處、工作組（領導幹部）、北京市委、中央文革小組各同誌討論一下，提出意見，可能有些收獲，然後酌加修改，再作報告，可能穩妥一些，請酌定。”劉少奇當然照辦，但當劉少奇的檢查作為正式文件下發時，毛澤東的批示被刪掉了。
毛澤東在中央工作會議上的講話，對劉、鄧的問題講得比較和緩。10月24日晚，他在彙報會上說：“把劉、鄧的大字報貼到大街上去不好”，“劉、鄧二人是搞公開的，不搞秘密的。對劉、鄧要準許革命，準許改。”“對少奇同誌不能一筆抹煞”。在10月25日的全體大會上，毛講話又說：“中央分一、二線，我也有責任，路線錯誤，改了就是了。”“也不能完全怪劉少奇同誌、鄧小平同誌。他們兩個同誌犯錯誤也有原因”。他還說，“北京的問題，到現在可以說基本解決了。”可見，毛澤東這時對劉少奇采用的是黨內矛盾的處理方法。但會後，群眾性的造反行動更加激烈。社會上攻擊劉少奇的舉動不斷升級。10月下旬，北京有的紅衛兵組織貼出了打倒劉少奇的標語口號。毛澤東此時也不同意把劉少奇問題捅到社會上，還派陳伯達去清華、北大製止過貼劉少奇的大字報。周恩來、陶鑄等中央領導也多次對群眾講，反對提“打倒劉少奇”的口號。
從1966年12月中旬起，打倒劉少奇的舉動驟然升級，劉少奇遭受到來自各方麵的更嚴重的迫害。
1966年12月18日，中央成立了王光美專案組，審查所謂“特務嫌疑”問題。名稱為中央辦公廳丙組，成員4人。12月18日下午，張春橋在中南海西門傳達室召見了清華大學著名造反組織“井岡山兵團”頭頭蒯大富，唆使他們采取行動搞臭劉、鄧。12月24日，戚本禹到北京礦業學院對師生們公開說：“劉、鄧是黨內最大的走資本主義道路的當權派”，汙蔑王光美是“徹頭徹尾的反革命分子”。12月25日，蒯大富組織了清華井岡山兵團的5000多人，在北京鬧市區遊行示威，撒傳單貼標語，發表演說，把打倒劉少奇、鄧小平的口號首先推向社會。12月27日，“中央文革”召開北京部分大中學校師生座談會，江青在會上鼓動說：“兩條路線鬥爭的勝負還沒有定，階級鬥爭激烈得很，劉少奇的檢討不成樣子，在幹部中沒法通過。”她還教唆紅衛兵說，對劉少奇“你們要背對背，不要死揪回來，其他怎麼做都行。”他們一夥還汙蔑紀錄影片《劉少奇主席訪問印度尼西亞》是大毒草，要紅衛兵立即組織批判。12月30日，江青來到清華大學，單獨召見了劉少奇女兒劉濤，策動劉濤起來揭發批判劉少奇。江青對劉濤說：“劉少奇問題的性質早已定了，是反黨反社會主義。現在不打倒他，是因為全國人民轉不過彎來，要一步一步來。你要徹底和他劃清界限。”隨後，劉濤根據訪問生母王前提供的材料，寫了長達數萬字的揭發批判劉少奇的大字報，主要是生活上的事情。大字報經紅衛兵小報大量登載、轉載，影響非常大。
11月25日，劉少奇陪同毛澤東第八次接見紅衛兵，最後一次在公開場合出現。此後，劉少奇實際上失去了人身自由，遭到無情的批判鬥爭，殘酷的迫害接踵而來。
12月23日下午，中南海院內出現了第一批點名攻擊劉少奇、王光美的大字報。1967年元旦清晨6點鍾，一些人到劉少奇住宅院內，張貼書寫“打倒中國的赫魯曉夫劉少奇”之類的標語。1月3日晚，中南海秘書局20多人衝到劉家，張貼標語，勒令劉少奇、王光美站到走廊門口，進行了40分鍾的批鬥。當他們強迫劉少奇背語錄，嘲笑起哄時，劉少奇義正詞嚴地回答說：“你們可以問我毛主席的哪篇文章，寫的什麼內容，當時的曆史背景，針對什麼問題，當時所起的作用，理論上有何創新，這才是毛主席思想的精髓。我是《毛澤東選集》編輯委員會主任，無論哪篇文章，我都可以解答。”這是第一次對劉少奇進行的麵對麵的批鬥。
1967年1月6日，清華大學“井岡山兵團”的一些人把劉少奇的女兒劉平平扣留在學校，詐稱她在學校作檢查後的歸途中被車軋傷，需要截肢，把劉少奇、王光美騙到了醫院，然後劫持王光美到清華批鬥。周恩來得知後，立即打電話批評蒯大富，並派秘書到清華大學限令蒯大富放人。
1月12日晚，中辦秘書局七八十人先後衝進劉少奇、鄧小平、陶鑄的住處，對他們進行了圍攻批鬥。劉少奇受到低頭彎腰的批鬥體罰。王光美站在一張獨腿桌子上挨批。
1月13日深夜，毛澤東在人民大會堂臨時住處派秘書徐業夫用車接劉少奇來談話。劉少奇鄭重向毛澤東提出兩條：“一、這次路線錯誤的責任在我，廣大幹部是好的，特別是許多老幹部是黨的寶貴財富，主要責任由我來承擔，盡快把他們解放出來，使黨少受損失；二、辭去國家主席，中央委員和《毛澤東選集》編委會主任職務，和妻子兒女去延安或老家種地，以便盡早結束文化大革命，使國家少受損失。”毛澤東沉默了一會兒，建議劉少奇認真讀幾本書，還特別介紹了德國動物學家海格爾的《機械唯物主義》和法國18世紀哲學家狄德羅的《機械人》。臨行時，毛澤東親自送到門口，囑咐劉少奇“好好學習，保重身體”。劉少奇的辭職要求，不久前曾向周恩來口頭提出過。與毛澤東的會見，曾使劉少奇的心情寬鬆了一時。但五天後，中南海電話局一夥造反派闖進劉少奇的辦公室，撤了劉少奇的電話。從此，劉少奇與毛澤東、周恩來及中央政治局的一切聯係都被切斷了。
此時，毛澤東的態度與要把劉少奇搞成敵我矛盾的江青一夥還是明顯有所不同。1967年1月初，北京建工學院的紅衛兵組織“八一戰鬥團”勒令劉少奇到他們學院作檢查。毛澤東不同意劉少奇去，於1月6日給周恩來一個批示：“總理：此件請你酌處，我看還是不宜去講，請你向學生方麵做些工作。”周恩來執行了這一批示。2月12日至18日，毛澤東三次與張春橋、姚文元談話，對他們說：劉少奇的《論共產黨員的修養》，我看過幾遍，是反馬列主義的。劉少奇看來九大還要選他當中央委員。現在不要掛牌子、戴高帽子。這表明，毛澤東當時還是把劉少奇的問題作為黨內矛盾，是要以黨內路線鬥爭的方式解決的。
三、殘酷的迫害和劉少奇冤案的鑄成
到1967年的3月間，毛澤東對劉少奇的態度有了新的變化。康生利用一份誣蔑劉少奇是“叛徒”的材料，給毛澤東寫了報告，稱他已掌握確鑿材料，證明劉少奇在曆史上有重大叛變嫌疑問題，建議中央對劉少奇進行專案審查。3月21日，毛澤東批準了康生的報告。中央常委決定審查劉少奇1925年、1927年、1929年、1936年的所謂“叛徒嫌疑”問題。6月3日，劉少奇、王光美專案組成立。中央決定審查劉少奇後，劉少奇問題的性質發生了變化，對劉少奇的批判鬥爭隨之升級。
在3月召開的軍以上幹部會議和4月間召開的軍委擴大會議上，陳伯達、康生等人講話，從曆史到現實的一係列重大問題上汙蔑劉少奇、鄧小平、彭真，顛倒是非地批判了劉少奇發展生產力的主張，並傳達了毛澤東2月份與張、姚談話中有關批判《論共產黨員的修養》的意見。
劉少奇與外界的聯係切斷後，他的子女們從街上帶回的傳單小報和所見所聞就成了重要的信息來源。3月28日，子女們從街上帶回了一些傳單小報，其中一張小報說，劉少奇曾吹捧電影《清宮秘史》是“愛國主義”的，還說劉少奇自詡為“紅色買辦”。劉少奇敏銳地覺察到，這是一個不尋常的信號，立即回辦公室給毛澤東寫了一封信，申明從來沒有說過這句話，願意和揭發人對質。