（8）冰乙酸。
（9）0.25g/mL鹽酸羥胺溶液。
（10）1.0mol/L對-甲苯磺酸溶液：稱取17.2g對-甲苯磺酸，用水溶解並定容至100mL。
（11）2%（體積分數）甲酸溶液。
（12）5%（體積分數）乙酸銨甲醇溶液：量取5mL乙酸銨緩衝溶液用甲醇定容至100mL。
（13）陽離子交換柱：MCX，60mg/3mL，使用前依次用3mL乙腈、3mL甲酸溶液活化。
（14）中性氧化鋁柱：1g/3mL，使用前用5mL乙腈活化。
（15）標準品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、同位素內標氘代孔雀石綠（D5-MG）、同位素內標氘代隱色孔雀石綠（D6-LMG），純度大於98%。
（16）標準貯備溶液：精確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠標準品，用乙腈分別配製成100μg/mL的標準貯備液。
（17）混合標準貯備溶液（1μg/mL）：分別精確吸取1.00mL孔雀石綠、隱色孔雀石綠的標準貯備溶液至100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，1mL該溶液分別含1μg的孔雀石綠、隱色孔雀石綠。-18℃避光保存。
（18）混合標準貯備溶液（100ng/mL）：用乙腈稀釋混合標準貯備溶液，配製成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠均為100ng的混合標準貯備溶液。-18℃避光保存。
（19）混合內標標準溶液：用乙腈稀釋標準溶液，配製成每毫升含氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠各100ng的內標混合溶液。-18℃避光保存。
（20）混合標準工作溶液：根據需要，臨用時吸取一定量的混合標準貯備溶液和混合內標標準溶液,用乙腈-5mmol/L乙酸銨溶液（1+1）稀釋配製適當濃度的混合標準工作液，每毫升該混合標準工作溶液含有氘代孔雀石綠和氘代隱色孔雀石綠各2ng。
3.儀器
高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（配有電噴霧離子源）；勻漿機；離心機（4000r/min）；超聲波水浴；旋渦振蕩器；KD濃縮瓶（25mL）；固相萃取裝置；旋轉蒸發儀。
4.檢驗方法
（1）樣品製備
①提取
鮮活水產品：稱取5.00g已搗碎樣品於50mL離心管中，加入200μL混合內標標準溶液，加入11mL乙腈，超聲波振蕩提取2min，8000r/min勻漿提取30s，4000r/min離心5min，上清液轉移至25mL比色管中；另取一支50mL離心管加入11mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10s，洗滌液移入前一支離心管中，用玻棒搗碎離心管中的沉澱，旋渦振蕩器上振蕩30s，超聲波振蕩5min，4000r/min離心5min，上清液合並至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，搖勻備用。
加工水產品：稱取5.00g已搗碎樣品於100mL離心管中，加入200μL混合內標標準溶液，依次加入1mL鹽酸羥胺、2mL對-甲苯磺酸、2mL乙酸銨緩衝溶液和40mL乙腈，勻漿2min(10000r/min)，離心3min(3000r/min)，將上清液轉移到250mL分液漏鬥中，用20mL乙腈重複提取殘渣一次，合並上清液。於分液漏鬥中加入30mL二氯甲烷、35mL水，振搖2min，靜置分層，收集下層有機層於150mL梨形瓶中，再用20mL二氯甲烷萃取一次，合並二氯甲烷層，45℃旋轉蒸發近幹。
②淨化
鮮活水產品：移取5.00mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱上，用KD濃縮瓶接收流出液，4mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45℃旋轉蒸發至約1mL，殘液用乙腈定容至1.00mL，超聲振蕩5min,加入1.0mL 5mmol/L乙酸銨溶液，超聲振蕩1min，樣液經0.2μm濾膜過濾後供液相色譜-串聯質譜測定。
加工水產品：將中性氧化鋁柱串接在陽離子交換柱上方。用6mL乙腈分3次（每次2mL），用旋渦振蕩器渦旋溶解上述提取物，並依次過柱，控製陽離子交換柱流速不超過0.6mL/min，再用2mL乙腈淋洗中性氧化鋁柱後，棄去中性氧化鋁柱。依次用3mL 2%（體積分數）甲酸溶液、3mL乙腈淋洗陽離子交換柱，棄去流出
液。用4mL 5%（體積分數）乙酸銨甲醇溶液洗脫，洗脫流速為1mL/min，用10mL刻度試管收集洗脫液，用水定容至10.0mL，樣液經0.2μm濾膜過濾後供液相色譜-串聯質譜測定。
（2）測定
①液相色譜-串聯質譜條件
色譜柱：C18柱，50mm×2.1mm（i.d.），粒度3μm。
流動相：乙腈-5mmol/L乙酸銨（75+25）。
流速：0.2mL/min。
柱溫：35℃。
進樣量：10μL。
離子源：電噴霧ESI，正離子。
掃描方式：多反應監測MRM。
霧化氣、窗簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮氣；使用前應調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。
噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應優化至最優靈敏度。
監測離子對：孔雀石綠m/z 329/313（定量離子）、329/208；隱色孔雀石綠m/z 331/316（定量離子）、331/239；氘代孔雀石綠m/z 334/318（定量離子）；氘代隱色孔雀石綠m/z 337/322（定量離子）。
②液相色譜-串聯質譜測定：
按照液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和混合標準工作溶液，以色譜峰麵積按內標法定量，孔雀石綠以氘代孔雀石綠為內標物計算，隱色孔雀石綠以氘代隱色孔雀石綠為內標物計算。在上述色譜條件下孔雀石綠、氘代孔雀石綠、氘代隱色孔雀石綠、隱色孔雀石綠的參考保留時間分別為2.27min、2.30min、5.21min、5.31min。
③液相色譜-串聯質譜確證：
按照液相色譜-串聯質譜條件測定樣品和標準工作溶液，分別計算樣品和標準工作溶液中非定量離子對與定量離子對色譜峰麵積的比值，僅當兩者數值的相對偏差小於25%時方可確定兩者為同一物質。
④空白試驗：除不加試樣外，均按上述測定步驟進行。
5.計算
本方法孔雀石綠的殘留量測定結果係指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量的之和，以孔雀石綠表示。
本方法孔雀石綠、隱色孔雀石綠的檢測限均為0.5μg/kg。
（二）高效液相色譜法
1.原理
試樣中的殘留物用乙腈-乙酸鹽緩衝混合液提取，乙腈再次提取後，液液分配到二氯甲烷層並濃縮，經酸性氧化鋁柱淨化後，高效液相色譜-PbO2柱後衍生測定，外標法定量。
2.試劑和材料
(1)乙腈：液相色譜純。
(2)甲醇：液相色譜純。
(3)乙酸鹽緩衝液：溶解4.95g無水乙酸鈉及0.95g對-甲苯磺酸於950mL水中,用冰乙酸調節溶液pH到4.5,最後用水稀釋到1L。
(4)20%鹽酸羥胺溶液。
(5)1.0mol/L對-甲苯磺酸：稱取17.2g對-甲苯磺酸，並用水稀釋至100mL。
(6)50mmol/L乙酸銨緩衝溶液：稱取3.85g無水乙酸銨溶解於1000mL水中，冰乙酸調pH到4.5。
(7)二甘醇。
(8)酸性氧化鋁：80～120目。
(9)矽藻土545：色譜層析級。
(10)標準品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG），純度大於98%。
(11)標準溶液：精確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠，用乙腈分別配製成100μg/mL的標準貯備液，再用乙腈稀釋配製1μg/mL的標準溶液。-18℃避光保存。
(12)混合標準工作溶液：用乙腈稀釋標準溶液，配製成每毫升含孔雀石綠、隱色孔雀石綠均為20ng的混合標準溶液。-18℃避光保存。
3.儀器
高效液相色譜儀（配有紫外-可見光檢測器）；勻漿機；離心機（4000r/min）；固相萃取裝置；25% PbO2氧化柱（不鏽鋼預柱管，兩端附2μm過濾板，抽真空下，填裝含有25% PbO2的矽藻土，添加數滴甲醇壓實，旋緊。臨用前用甲醇衝洗。並將PbO2氧化柱連接在紫外-可見光檢測器與液相色譜柱之間）；酸性氧化鋁柱（0.33g/mL，使用前用5mL乙腈活化）。
4.檢驗方法
（1）提取
稱取5.00g樣品於50mL離心管內，加入1.5mL 20%的鹽酸羥胺溶液、2.5mL 1.0mol/L對-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸鹽緩衝溶液，用勻漿機以10000r/min的速度均質30s，加入10mL乙腈劇烈振搖30s。加入5g酸性氧化鋁，再次振蕩30s。3000r/min離心10min。把上清液轉移至裝有10mL水和2mL二甘醇的100mL離心管中。然後在50mL離心管中加入10mL乙腈，重複上述操作，合並乙腈層。
（2）淨化
在離心管中加入15mL二氯甲烷,振蕩10s，3000r/min離心10min，將二氯甲烷層轉移至100mL的梨形瓶中，再用5mL乙腈、10mL二氯甲烷重複上述操作一次，合並二氯甲烷層於100mL梨形瓶中。45℃旋轉蒸發至約1mL，用2.5mL乙腈溶解殘渣。
將酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，將梨形瓶中的溶液轉移到柱上，再用乙腈洗滌瓶2次，每次2.5mL，把洗滌液依次通過柱，控製流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液，45℃旋轉蒸發至近幹，殘液精確用0.5mL乙腈溶解，過0.45μm濾膜，濾液供液相色譜測定。
（3）測定
①液相色譜條件
色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm（i.d.）。在C18色譜柱和檢測器之間連接25% PbO2氧化柱。
流動相：乙腈和乙酸銨緩衝溶液。
流速：1.0mL/min。
柱溫：室溫。
檢測波長：618nm。
進樣量：50μL。
②液相色譜測定：
根據樣液中被測孔雀石綠、隱色孔雀石綠含量情況，選定峰高相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣液中孔雀石綠、隱色孔雀石綠響應值均應在儀器檢測線性範圍內。對標準工作溶液和樣液等體積參插進樣測定。在
上述色譜條件下，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的保留時間約為6.10min和17.77min。
同時進行空白試驗。
5.計算
本方法孔雀石綠的殘留量測定結果係指孔雀石綠和它的代謝物隱色孔雀石綠殘留量的之和，以孔雀石綠表示。
本方法孔雀石綠和隱色孔雀石綠的檢測限均為2.0μg/kg。
思考題
1.肉禽及其製品的質量標準主要是哪兩項？其感官指標又是由哪幾項決定？
2.凍分割牛肉、廣式臘肉、板鴨（鹹鴨）、分割凍雞肉的一級品、二級品、三級品感官指標各有何區別？
3.新鮮豬肉、次鮮豬肉、變質豬肉的外觀檢查與鑒別、氣味鑒別、彈性檢查與鑒別、脂肪鑒別、肉湯檢驗與鑒別各有何不同？
4.如何采用pH試紙快速測定法判斷健康牲畜肉、次鮮肉、變質肉？
5.簡述肉製品中澱粉含量的測定方法。
6.簡述肉製品中揮發性鹽基氮的測定原理。
7.簡述鮮蛋的感官指標。
8.簡述鮮蛋的銷售分級標準。
9.如何靠眼看、手摸、耳聽、鼻嗅等方法檢驗殼蛋？
10.采用燈光透照、外觀鑒別如何區別良質、次質、劣質皮蛋？
11.如何在7%、8%、10%、11%的鹽水溶液中觀察其沉浮情況來鑒別檢驗蛋的新鮮度。
12.一級鮮度、二級鮮度黃花魚的感官指標有什麼不同？
13.在進行魚的感官檢驗時，怎樣觀察其眼睛和鰓？怎樣檢查鱗片上的黏液來觀察和嗅聞？
14.良質、劣質蝦皮（熟蝦皮）的質量如何進行鑒別？