（3）滴定用標準鹽酸溶液滴定收集液，至藍綠色變為微紅色為終點，記錄鹽酸的消耗量。
同一試樣進行2次平行測定，並做空白試驗。
5.計算
注意事項：
（1）所用試劑應用無氨蒸餾水配製。
（2）稱樣後應盡可能將試樣移入凱氏燒瓶底部，避免沾在頸壁上。消化過程中應不時轉動凱氏瓶使附在瓶壁上的殘渣洗下，促其消化完全。
（3）硫酸鈉的作用是提高溶液的沸點，加速對有機物的分解。但硫酸鈉的用量不宜過多，否則因為溫度過高，生成的硫酸氫銨分解，會造成氮的損失。
（4）硫酸銅起催化的作用，同時指示消化終點的到達（藍綠色），蒸餾時也作為堿性反應的指示劑（加堿量不足時，消化液呈藍色不生成黑色沉澱）。
（5）蒸餾裝置不能漏氣。
（6）蒸餾時加堿量要充足。
（7）蒸餾完畢後，應先將冷凝管下端提離液麵並清洗管口，再蒸餾1min後關掉電源，否則可能造成吸收液倒吸。
六、亞硝酸鹽的測定（鹽酸萘乙二胺法）
1.原理
樣品經沉澱蛋白質、去除脂肪後，在弱酸性條件下，其中的亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，其最大吸收波長為538nm，可通過測定吸光度與標準進行比較定量。
2.試劑
（1）亞鐵氰化鉀溶液：稱取106g亞鐵氰化鉀［K4Fe(CN)6·3H2O］溶於水,定容至1000mL。
（2）乙酸鋅溶液：稱取220g乙酸鋅［Zn(CH3COO)2·2H2O］，加30mL冰乙酸，溶於水並定容至100mL。
（3）
硼砂溶液：稱取5g硼酸鈉（NaB4O7·10H2O），溶於100mL熱水中，冷卻備用。
（4）0.4%對氨基苯磺酸溶液：稱取0.4g對氨基苯磺酸，溶於100mL 20%鹽酸中，避光保存。
（5）0.2%鹽酸萘乙二胺溶液：稱取0.2g鹽酸萘乙二胺，以水定容至100mL，避光保存。
（6）氫氧化鋁乳液：溶解125g硫酸鋁［Al2(SO4)3·18H2O］於1000mL重蒸餾水中，使氫氧化鋁全部沉澱（溶液呈微堿性），用蒸餾水反複洗滌，再真空抽濾，直至洗液分別用氯化鋇、硝酸銀檢驗不發生混濁為止。取下沉澱物，加適量重蒸餾水，使其呈稀漿糊狀，搗勻後備用。
（7）亞硝酸鈉標準溶液：精確稱取0.1000g於矽膠幹燥器中幹燥24h的亞硝酸鈉（GR），加水溶解後移入500mL容量瓶中，並稀釋至刻度。此溶液每毫升相當於200μg亞硝酸鈉。
（8）亞硝酸鈉標準使用液（5μg/mL亞硝酸鈉，臨用前配製）。
3.儀器
小型絞肉機或組織搗碎機、分光光度計。
4.檢驗方法
（1）試樣中亞硝酸鹽的提取
肉類製品（除紅燒類外）：稱取攪碎並混合均勻的試樣 5g於50mL 燒杯中，加入硼砂飽和溶液12.5mL，以玻璃棒攪勻，然後以70℃左右重蒸餾水約300mL將其洗入500mL容量瓶中，置沸水浴中加熱15 min，取出，一邊轉動一邊加入亞鐵氰化鉀溶液5mL，搖勻，再加入乙酸鋅溶液5mL以沉澱蛋白質。定容，混勻，靜置0.5h，除去上層脂肪，過濾，棄去初濾液30mL，收集濾液備用。
紅燒類肉製品：前麵部分同上。取其濾液60mL於100mL容量瓶中，加氫氧化鋁乳液至刻度，過濾，濾液應無色透明。
（2）
繪製標準曲線吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0、1.5、2.0、2.5mL亞硝酸鈉標準使用液（依次相當於0、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5μg亞硝酸鈉），分別置於50mL比色管中，各加入0.4% 對氨基苯磺酸溶液1mL，混勻，靜置3～5min後各加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1.0mL，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色杯，以零管調零，於波長538nm處測定吸光度，繪製標準曲線。
（3）測定樣品吸取40mL樣品提取液於50mL比色管中，按繪製標準曲線的方法進行操作，於波長538nm處測吸光度，然後從標準曲線上查出測定用樣液中亞硝酸鈉的含量（μg/mL）。
5.計算
注意事項：
（1）鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液作為蛋白質沉澱劑，使產生的亞鐵氰化鋅沉澱與蛋白質產生共沉澱。
（2）蛋白質沉澱劑也可采用硫酸鋅（30%）溶液。
（3）飽和硼砂溶液的作用：一是亞硝酸鹽提取劑；二是蛋白質沉澱劑。
（4）本實驗中應用重蒸餾水，以減少誤差。
七、克侖特羅（“瘦肉精”）殘留的檢測
克侖特羅（Clenbuterol）俗稱“瘦肉精”，是一種平喘藥。此類化合物有促進生長作用，添加於飼料中能提高畜、禽的胴體瘦肉率，但克侖特羅對人體有害，人食用後會發生中毒，重者引起肌肉振顫、心動過速、神經過敏、頭痛、肌肉痛等症狀，也可導致死亡。2001年1月，浙江杭州市60多人到醫院就診，症狀為心慌、心跳加快、手顫、頭暈、頭痛等，原因是食用了含有“瘦肉精”的豬肉；2001年11月，廣東河源400多名市民“瘦肉精”中毒；香港2000年11月也檢出內地供香港豬肉中含有“瘦肉精”。國家早在1997年就禁止使用克侖特羅作畜禽飼料添加劑，但因“瘦肉精”能提高豬肉瘦肉率，給飼養者帶來可觀的經濟收入，所以執行困難。為保證肉品質量，防止“瘦肉精”給人們帶來的危害，檢疫部門對動物飼料和尿樣中的鹽酸克侖特羅進行檢測，有效地控製了豬肉質量。目前，國內外有關β-興奮劑殘留的檢測方法有4種：高效液相色譜法（HPLC法）、氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS法）、酶聯免疫法（ELISA法）和放射免疫分析法（RIA法）。現在介紹氣相色譜-質譜聯用法和高效液相色譜法。
（一）氣相色譜-質譜法（GC-MS）
1.原理
將固體試樣剪碎，用高氯酸溶液勻漿。液體試樣加入高氯酸溶液，進行超聲加熱提取，用異丙醇+乙酸乙酯（40＋60）萃取，有機相濃縮，經弱陽離子交換柱進行分離，用乙醇+濃氨水（98＋2）溶液洗脫，洗脫液濃縮，經N，O-雙三甲基矽烷三氟乙酰胺（BSTFA）衍生後於氣-質聯用儀上進行測定。以美托洛爾為內標，定量。
2.試劑
（1）克侖特羅（clenbuterol hydrochloride）,純度≥99.5%。
（2）美托洛爾（metoprolol），純度≥99%。
（3）甲醇：HPLC級。
（4）甲苯：色譜級。
（5）乙醇。
（6）衍生劑：N，O-雙三甲基矽烷三氟乙酰胺（BSTFA）。
（7）0.1mol/L HClO4溶液。
（8）1mol/L NaOH溶液。
（9）磷酸二氫鈉緩衝液（0.1mol/L， pH=6.0）。
（10）異丙醇+乙酸乙酯（40+60）。
（11）乙醇+濃氨水（98+2）。
（12）美托洛爾內標標準溶液：精確稱取美托洛爾標準品，用甲醇溶解配成濃度為240mg/L的內標貯備液，貯於冰箱中，使用時用甲醇稀釋成2.4mg/L的內標使用液。
（13）克侖特羅標準溶液：精確稱取克侖特羅標準品，用甲醇溶解配成濃度為250mg/L的標準貯備液，貯於冰箱中，使用時用甲醇稀釋成0.5mg/L的克侖特羅標準使用液。
（14）弱陽離子交換柱（LC-WCX）（3mL）。
（15）針筒式微孔過濾膜（0.45μm，水相）。
3.儀器
氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS），超聲波清洗器，酸度計，離心機，振蕩器，旋轉蒸發器，旋渦式混合器，恒溫加熱器，N2-蒸發器，勻漿器。
4.檢驗方法
（1）
提取稱取肌肉、肝髒或腎髒試樣10g（精確到0.01g），用20mL 0.1mol/L HClO4溶液勻漿，置於磨口玻璃離心管中，然後置於超聲波清洗器中超聲20min，取出置於80℃水浴中加熱30min。取出冷卻後離心（4500r/min）15min。傾出上清液，沉澱用0.1mol/L HClO4溶液5mL洗滌，再離心，將兩次的上清液合並。用1mol/L NaOH溶液調pH至9.5±0.1，若有沉澱產生，再離心（4500r/min）10min，將上清液轉移至磨口玻璃離心管中，加入氯化鈉8g，混勻，加入異丙醇＋乙酸乙酯（40+60）25mL，置於振蕩器上振蕩提取20min。提取完畢，放置5min（若有乳化層稍離心一下）。用吸管小心將上層有機相移至旋轉蒸發瓶中，用異丙醇＋乙酸乙酯（40＋60）25mL再重複萃取一次，合並有機相，於60℃在旋轉蒸發器上濃縮至近幹。用1mol/L NaH2PO4緩衝液（pH 6.0）1mL充分溶解殘留物，經針筒式微孔過濾膜過濾，洗滌3次後完全轉移至5mL玻璃離心管中，並用0.1mol/L NaH2PO4緩衝液（pH 6.0）定容至刻度。
（2）淨化依次用乙醇10mL、水3mL、0.1mol/L NaH2PO4緩衝液（pH 6.0）3mL、水3mL衝洗弱陽離子交換柱，取適量提取液至弱陽離子交換柱上，棄去流出液，分別用水4mL和乙醇4mL衝洗柱子，棄去流出液，用乙醇＋濃氨水（98＋2）6mL衝洗柱子，收集流出液。將流出液在N2-蒸發器上濃縮至幹。
（3）
衍生化於淨化、吹幹的試樣殘渣中加入100～500μL甲醇，50μL 2.4mg/L的內標使用液，在N2-蒸發器上濃縮至幹，迅速加入衍生劑（BSTFA）40μL，蓋緊塞子，在旋渦式混合器上混勻1min，置於75℃的恒溫加熱器中衍生90min。衍生反應完成後取出冷卻至室溫，在渦漩式混合器上混勻30s，置於N2-蒸發器上濃縮至幹。加入甲苯200μL，在渦漩式混合器上充分混勻，待氣質聯用儀進樣。同時用克侖特羅標準使用液做係列同步衍生。
（4）氣相色譜-質譜測定參數設定
氣相色譜柱：DB-5MS柱，30m×0.25mm×0.25μm。
載氣：He，柱前壓：55.2kPa。
進樣口溫度：240℃。
進樣量：1μL，不分流。
柱溫程序：70℃保持1min，以18℃/min速度升至200℃，以5℃/min的速度再升至245℃，再以25℃/min升至280℃並保持2min。