模板DNA的純化（使用膠回收試劑盒）：
(1)根據溶液的體積和所要回收DNA的含量,加入4倍體積的結合緩衝液2。如果溶液的體積不足50μL，加TE到50μL，再加200μL的結合緩衝液2。
(2)將融化的膠溶液轉移到套放在2mL收集管內的UNIQ-10柱中,室溫放置2min,8000r/min室溫離心1min。
（3）取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入500μL洗出溶液。8000r/min室溫離心1min。重複一次。
（4）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液。將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，12000r/min室溫離心2min。
（5）將UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL EP管中，在柱子膜中央加入40μL TE緩衝液放置5min。
（6）12000r/min室溫離心1min，離心管中的液體即為回收的DNA片段,可立即使用或保存於-20℃備用。
2.3.2PCR擴增
所用引物為真菌NS1,Fung-GC。反應體係為50μL總體積，ddH2O 40μL，10×Buffer（含2.0mmol/L MgCl2）5μL，dNTP（10mmol/L）1μL，Fung-GC（10μmol/L）1μL，NS1（10μmol/L）1μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA 2μL，用ddH2O補足體積至50μL。設置陰性對照。
反應程序：94℃ 5min預變性；94℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸1min，一共35個循環。最後延伸7min。22℃保存。
取PCR產物各2μL，1.5%瓊脂糖凝加5%核酸染料染液，1×TAE緩衝液，120V穩壓電泳15min，凝膠成像係統拍攝電泳圖譜，檢查擴增效果。
2.3.3變性梯度凝膠電泳DGGE
采用D-Code突變檢測係統對樣品進行DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%（丙烯酰胺：雙丙烯酰胺=37.5∶1），變性劑濃度為15%～40%（100%的變性劑為7mol/L尿素，40%甲酰胺）。在70V電壓下，60℃恒溫，1×TAE中電泳13h。電泳完畢後，用超純水衝洗膠，然後將膠放進含5%核酸染料的染液中，置於搖床上染色30min後，凝膠成像係統拍攝圖譜。
2.3.4DGGE條帶回收
對照DGGE圖譜，選取較有代表性的條帶，用潔淨的手術刀片將目標DGGE條帶完整地切下並裝入1.5mL離心管中，按試劑盒方法回收。對回收產物進行PCR擴增，回收產物。進行目的片段TA克隆後，選取陽性克隆培養後提取質粒，送上海生工測序，在GenBank數據庫比對。
3結果和分析
3.1大曲真菌群落結構分析
3.1.1大曲真菌DGGE圖譜
PCR產物DGGE電泳後獲得了八個大曲樣品的DGGE指紋圖譜,每一條泳道代表一種大曲樣品真菌的DGGE指紋圖譜,不同位置的條帶代表不同種屬的真菌。
3.1.2大曲真菌多樣性分析
大曲真菌DGGE圖譜顯示，每個泳道出現數量不等的清晰條帶，表明各樣品PCR產物通過DGGE實現了較好的分離，測序結果顯示大曲中優勢種群主要有透孢犁頭黴、曲黴、根黴、總狀毛黴、散囊菌、釀酒酵母、東方伊薩酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、假絲酵母、結合酵母和畢赤酵母等。與條帶D同源性最高的是總狀毛黴（Mucor racemosus），與條帶R同源性最高的是毛根黴（Rhizomucor miehei），毛黴的用途很廣，常出現在酒藥中，能糖化澱粉並生成少量乙醇，產生蛋白酶，有分解蛋白質的能力，我國多用來做豆腐乳、豆豉。許多毛黴能產生草酸、乳酸、琥珀酸、乙酸及甘油等，有的毛黴能產生脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。與條帶F同源性最高的是透孢犁頭黴（Absidia hyalospora），與條帶Ⅰ同源性最高的是喜溫愛達荷犁頭黴（Absidia idahoensis），犁頭黴廣泛分布於土壤和酒曲中，是製酒生產的汙染菌。與條帶B同源性最高的是Aspergillus niger，與條帶C同源性最高的是米曲黴（Aspergillus oryzae），曲黴(Aspergillus)是發酵工業和食品加工業的重要菌種，是釀酒、製醋曲的主要菌種，曲黴能生產澱粉酶、蛋白酶和果膠酶，能代謝檸檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等有機酸。與條帶K同源性最高的是米根黴（Rhizopus oryzae），與條帶L同源性最高的是少根根黴（Rhizopus arrhizus），根黴在自然界分布很廣，用途廣泛，其澱粉酶活性很強，是釀造工業中常用糖化菌，根黴能代謝延胡索酸、L-乳酸和丁烯二酸等有機酸，還能產生芳香性的酯類物質，其代謝產物對白酒質量影響較大。與條帶O同源性最高的是紅色紅曲黴(Monascus ruber strain)，紅曲黴是腐生真菌，生長的最適pH為3.5～5，尤嗜乳酸，生長最適溫度32～35℃，能耐10%乙醇，能利用糖、酸為碳源，產生澱粉酶、蛋白酶、檸檬酸、琥珀酸和乙酸等，該菌株胞外酯酶具有較強的催化己酸乙酯合成的能力。與條帶P同源性最高的是蠟葉散囊菌（Eurotium herbariorum），蠟葉散囊菌本屬諸種都是嗜高滲透壓的，在一般的培養基上生長不良或不能生長，在低水活度培養基上生長正常。由於在較低水活度下能發育生長，所以該菌是引起穀物和工業器材黴腐的重要菌類，我國大量邊銷的茯磚茶，以其中的所謂“黃黴菌”或“金花”（即茶磚上的“小黃點”）的多少作為鑒定品質好壞的重要標誌，這些黃色小點實際上是本屬某些菌種產生的黃色閉囊殼，被認為是茯磚茶發酵中的益菌，本屬中阿姆斯特丹散囊菌（E.amstelodami）、蠟葉散囊菌（E.herbariorum）等分布極為普遍。