蔡元培參與暗殺組織，專學製造炸彈，賃屋購儀器藥品，由黃興帶來十餘枚彈殼，遂填以炸藥。吳樾暗藏炸彈，計劃行刺五大臣於北京車站，不幸炸藥誤發，竟以身殉。
1905年8月間，留日十七省革命誌士在東京發起“中國同盟會”，以孫中山為總理，誓言“驅逐韃虜，恢複中華，創立民國，平均地權”。本部之下，設立各省分會。上海分會由蔡元培擔任分會長，光複會會員也大半加入同盟會籍。蔡元培以愛國女學校作為革命同誌的接洽機關，並提供教員資格給徐錫麟、陶成章、楊篤生、黃興等革命同誌作為革命活動的社會身份。
同年，章太炎出獄，可是鄒容卻病死獄中。在鄒容追悼大會上，蔡元培當眾演說，痛詆清廷的暴虐，蔑視人權，聽者無不動容。鄒容墓前紀念塔落成，蔡元培又作演說，演辭特別警策，陳英士聞而感惜，返裏變賣不動產，決心從事革命工作，他後來成就的事業實發端於此。
當時國內的革命人士主要集中策劃暗殺和暴動，但暗殺工作不能順利開展，革命的方針和步驟也無法確定，因此大家對革命的前景仍然非常黯淡。蔡元培的內心不免會有失落的感覺，因此改變一下生活環境的欲望便愈來愈強烈。到這年秋天，聽聞清廷有派遣編修、檢討出洋留學之議，便決定進京銷假，申請留學歐洲。臨行，把同盟會幹事一職托他弟子黃炎培代理，並將秘密文件及名單多種交給他保管。蔡元培離開上海，獨自前往闊別了8年的北京。
光緒三十二年（1906）秋，蔡元培跑到北京，一心想申請去德國，但因政府絀於經費，無法派出。後在譯學館任教，等待出國時機。譯學館後來歸並京師大學堂，而1912年京師大學堂改為北京大學，所以蔡元培這次在譯學館的任教，實在是服務於北大的第一次。他的《中國孫寶琦像倫理學史》一書就是在這段時期寫成的。
1907年4月，清政府派孫寶琦為出使德國大使，孫寶琦允每月資助元培學費30兩，而商務印書館又與蔡元培訂定每月送編譯費百元。基本生活費用問題既已解決，元培遂隨孫寶琦赴德留學。這一年蔡元培已四十一歲，作為一個留學生，年紀似乎大了一點；可是，他時常想爭取進修機會以充實自己的學問，這種好學的精神，實在令人敬佩。
蔡元培在德留學，直至辛亥年（1911）革命成功，始回中國，前後有四年。他進入萊比錫大學專攻哲學，在校期間翻譯德國哲學家包爾生所著的《倫理學原理》，由上海商務印書館出版。在他初到柏林時，即聞徐錫麟起義於安慶，被執就義；不久，秋瑾又密謀在紹興起義，也被捕遇害，光複會的力量大受摧殘。
當時，吳敬恒、李石曾、張靜江等在法國巴黎出版《新世紀》周報，宣傳無政府主義，並反對君主立憲，提倡革命。蔡元培受無政府主義思想的影響，在德國也作精神上的呼應。辛亥年4月27日，黃興所領導的廣州起義雖然失敗，卻轟動全國，革命情緒自此更趨高漲。10月10日武昌起義.武昌光複後，鄂軍政府旋告成立。
蔡元培得吳敬恒在倫敦寄出的信，始知武漢的消息。他在致吳敬恒的信中，有“弟恐不能久留此間”之語，暗示打算回國赴難、共同奮鬥的意向。其後，接陳英士電報，催他回國。於是結束四年的留學生涯，取道西伯利亞東歸。抵達上海之日，正是黃興由武昌抵滬之時，即12月1日前後，孫中山尚未返國。他一時沒有住處，蔣維喬留他住在愛國女學校內。
12月4日，各省代表議決以南京為臨時政府所在地，黃興當選為大元帥，黎元洪當選為副元帥。孫中山亦於年底返國，旋即當選為臨時大總統，以1912年1月1日為中華民國元年元旦，此後改用陽曆。是日孫中山就職於南京，著手組織內閣。各省代表會正式開會，通過國務員名單，各部門總長依次為：陸軍黃興、海軍黃鍾瑛、外交王寵惠、財政陳錦濤、司法伍廷芳、內務程德全、教育蔡元培、實業張謇、交通湯壽潛，中華民國第一次臨時政府至此完全成立。