13.5.2開發單鏈片段抗體成為導入siRNA的生物導彈
單鏈片段抗體（ScFv）是指通過基因重組技術，人工表達保留了與抗原特異性結合的免疫球蛋白Fab單個片段，包含一段重鏈和一段輕鏈，兩鏈之間通過短多肽鉸鏈連接。ScFv擁有單克隆抗體無可比擬的優勢：①具有抗原識別和結合特異性，目標靶向性好。②不含抗體Fc段，對機體免疫原性低。③分子小，與荷正電的多肽重組成融合蛋白後，易於攜帶基因物質。④在非靶向組織中滯留時間短，血液清除快，組織穿透力強。⑤體外用免疫學方法篩選便利。⑥ScFv能在細菌中表達，易於基因操作和基因工程大量生產，並可用基因工程方法構建與其他效應分子連接的抗腫瘤融合蛋白。基於上述優點，ScFv已成為將藥物和基因等物質導向腫瘤的理想物質，極有可能成為乳腺癌生物治療的靶點。另外，針對腫瘤的生物學特性，有效的抗腫瘤生物治療要求能在體內長期維持抗癌物質的釋放。采用脂質體包裹的抗癌藥物能在機體內長期維持穩定的血藥濃度。構建ScFv與脂質體的複合體（ScFv免疫脂質體），能有效地濃縮抗癌藥物、細胞毒素或基因物質（如siRNA），選擇性地導入Her2陽性乳腺癌細胞，大大增強了殺傷癌細胞的能力。因此，應用經過ScFv修飾的免疫脂質體，既能把siRNA選擇性導入目標細胞，又能使siRNA持續釋放，達到長期治療的目的。
理想的抗Her2受體ScFv（又稱F5），不但能與癌細胞表麵Her2受體結合並減少其表達，還可用作導向抗癌藥物基因物質攻擊Her2高表達癌細胞的生物導彈，目前已有多個實驗室成功篩選合成並已初步應用。抗Her2 ScFv（F5）生物導彈構建方案是通過構建抗F5與各種多肽的融合蛋白（如魚精蛋白多肽PS，MPG多肽和tat多肽等），這些帶正電荷的多肽，能與帶負電荷的DNA質粒載體或siRNA結合，並可濃縮這些DNA和siRNA分子，經與癌細胞Her2受體介導進入細胞內，已經證實具有較好的導向效果。在體外細胞培養實驗中，應用F5PS融合蛋白攜帶報告基因，能大大提高報告基因在Her2陽性的乳腺癌細胞中的表達。與同源的Her2陰性細胞比較，報告基因表達能提高8～10倍。
極具開發潛能。siRNA與DNA都是攜帶大量負電荷的分子，也能被荷正電的多肽濃縮，一旦成功導入目標靶細胞，將發揮其特定功能。例如，篩選構建F5PS融合蛋白，應用於導向攜帶Her2 siRNA雙鏈分子，特異性地投入Her2陽性乳腺癌細胞。既可利用ScFv迅速減少細胞表麵的Her2分子，也可通過RNA幹擾從基因水平減少Her2 mRNA表達，可望徹底地杜絕Her2的過量表達，達到有效治療腫瘤的目的。
Morassco等成功構建了Her2 ScFv與刪節型魚精蛋白多肽（PS）融合蛋白的杆狀病毒表達載體（pAcGP67BF5PS），所表達的帶有6個組氨酸尾巴（HisTag）的F5PS融合蛋白具有結合乳腺癌細胞表麵Her2受體和濃縮DNA的雙向功能，並能把目標DNA選擇性導入Her2陽性細胞進行表達。本課題組應用pAcGP67BF5PS載體，與杆狀病毒包膜質粒DNA（bacuoGold bright DNA，BDPharmingen公司）一起共轉染Sf21細胞，裝配病毒載體顆粒，感染Sf9細胞，收集細胞裂解液及上清液分別經蛋白L和HisTag蛋白分離柱進行雙重純化，用抗人IgG單抗作為一抗的Western blot鑒定分離的融合蛋白。
實驗結果證實經病毒載體感染的Sf9細胞裂解液可以純化出較大量純度高的F5PS融合蛋白。進一步檢驗F5PS攜帶siRNA和靶向導入Her2陽性細胞的雙向功能。利用100pmol熒光素（FITC）標記的GFP siRNA與不同量的F5PS和L-蛋白珠（Lprotein beads，能結合人IgG）進行免疫共沉澱，通過分光計定量檢測FITCsiRNA。（JP+1）結果顯示F5PS與siRNA的飽和結合力摩爾比約為1：（KG-2）6。接著用F5PS攜帶GFP siRNA（1：（KG-2）6摩爾比），處理Her2基因表達載體（pCMVErbB2）轉染的HeLa細胞（效率達89％），采用改良Northern blot檢測細胞內GFP siRNA的含量。結果顯示F5PS有效地把GFP siRNA導入Her2陽性細胞，而且隨著siRNA量的增加（100pmol、500pmol、1000pmol），細胞內檢測到的siRNA信號也越強，具有明顯量效關係。而作為對照的不含魚精蛋白多肽片段（PS）的F5攜帶GFP siRNA處理組和Her2陰性細胞則不能檢測到siRNA信號。證實F5PS融合蛋白能有效地把siRNA選擇性地導入Her2陽性細胞內。進一步利用共聚焦顯微鏡定位檢測F5PS導入FITCsiRNA在細胞內的分布，發現siRNA分布於Her2陽性HeLa細胞的胞漿中，而Her2陰性細胞則沒有siRNA。上述實驗充分證實了F5PS具有攜帶siRNA和特異導入Her2細胞的雙向功能。
那麼，怎樣才能檢驗F5PS導入的siRNA沉默細胞目的基因的表達呢？我們采用穩定表達GFP的HeLa細胞，通過轉染pCMVErbB2而表達Her2受體（轉染效率約85％）。然後，用F5PS（1：6摩爾比）攜帶不同量的GFP siRNA處理細胞，流式細胞儀檢測GFP表達量的變化。對照組采用GFP siRNA或F5PS單獨處理細胞，或F5PS攜帶序列相反的Inverted GFP siRNA以排除非特異的siRNA幹擾作用，或采用不融合魚精蛋白多肽片段的F5攜帶GFP siRNA，或采用沒有轉染pCMVErbB2的Her2陰性細胞。實驗結果顯示，所有對照GFP HeLa細胞GFP表達量沒有變化，而F5PS導入GFP siRNA有效地抑製了GFP表達，而且隨著GFP siRNA量的增加沉默的效應也逐步增強。更能說明問題的是，作為內對照，同一細胞群內（接受了pCMVErbB2轉染的細胞）沒有表達Her2的HeLa GFP細胞在處理後GFP水平沒有下降，這說明F5PS攜帶siRNA選擇性導入Her2陽性細胞能特異地抑製目標基因表達。
綜上所述，Her2 ScFv與魚精蛋白片段多肽結合而成的融合蛋白（F5PS）能在杆狀病毒表達係統表達純化，而且具有濃縮siRNA和選擇性把siRNA導入Her2陽性細胞、沉默目標基因的功能，為腫瘤細胞靶向導入的研究工作奠定基礎。可見，單鏈片段抗體融合蛋白能在體內高效地導入siRNA並發揮強大的沉默基因效應，可望成為導入siRNA靶向腫瘤細胞的生物導彈。