13.1.3.3腺病毒載體
腺病毒2型（Ad2）和5型（Ad5）對人類沒有大的致病性，常用作基因治療載體。腺病毒載體的優點是導入效率明顯高於逆轉錄病毒，可製備的病毒滴度高，對分裂和非分裂細胞都有感染性。缺點是無靶向性，插入片段一般也不能大於8kb，而且能引起機體較強的免疫反應，使外源基因不能在體內長期表達。第1代腺病毒載體是缺失了E1A區、E1B區及E3區的複製缺陷型病毒載體，缺失的E1區一般由輔助細胞（293細胞係）提供，293細胞係的基因組中含有能夠穩定表達的Ad E1區基因，但是載體與表達E1蛋白的293細胞之間存在同源序列，載體在細胞中繁殖時可通過同源重組重新獲得E1區，而轉變為複製型腺病毒。而且載體仍能表達E2蛋白，會激發機體免疫反應。第2代腺病毒載體是病毒基因組的E2A區缺失，並突變或缺失E4區基因。
腺病毒載體的主要優點有以下幾個方麵：①腺病毒載體的滴度高，適宜於大量表達目標基因；②很多不同類型的組織細胞都可以被腺病毒感染，也就是說，腺病毒載體能感染的細胞譜很廣；③與逆轉錄病毒的最大差異是，腺病毒載體感染目標細胞不要求細胞處於分裂期；④腺病毒載體可以攜帶大基因片段。上述優點的前三個方麵都提示腺病毒載體很適合於攜帶表達siRNA/shRNA的表達序列，可以用於導入siRNA。目前用於攜帶基因的腺病毒載體多屬於第5血清型的複製自限性腺病毒（pAdEasy1），該載體在腺病毒的基礎上刪節了病毒E1和E3基因，使病毒不能自行複製，不會導致感染性疾病的發生。此外，該病毒載體係統的構建采用了大腸杆菌高效的同源重組技術，因此，pAdEasy1腺病毒骨骼質粒可以與攜帶H1或U6啟動子的穿梭質粒進行同源重組，適宜於構建攜帶表達siRNA的Pol Ⅲ啟動子的腺病毒載體。首先，把Pol Ⅲ啟動下的siRNA表達序列克隆到無啟動子的腺病毒穿梭質粒相應的酶切位點，構建攜帶siRNA表達序列的穿梭質粒pShuttleH1，然後用pShuttleH1（U6）與pAdEasy1進行同源重組，製成pAdH1載體，通過轉染293細胞，收集上清病毒，即可濃縮待用。
動物實驗表明，腺病毒載體引起的宿主炎症和免疫反應較弱，而目的基因的表達時間更長。為了降低載體的免疫原性，又進一步將病毒所有編碼基因全部缺失，而隻保留了末端反向重複（ITR）序列和psi包裝信號，構建成了所謂的“無腸（gutless）”載體，能攜帶更大容量的外源基因片段。此載體幾乎沒有免疫原性，而且仍能在293細胞係中產生高滴度的類病毒顆粒，但是這種設計對輔助病毒的複製無法控製，在生產“無腸”病毒載體過程中同時產生大量輔助病毒，很難進行分離純化。另外為了提高腺病毒載體的靶向特異性，可去除病毒與受體（柯薩奇腺病毒受體）的親和性，經特異性細胞結合分子模擬腺病毒纖維衣殼蛋白，使載體選擇性靶向相應細胞，減少載體的非特異性感染及免疫反應。與以上複製缺陷型載體不同，在腫瘤的基因治療中，選擇性複製型腺病毒載體的治療作用要明顯高於複製缺陷型腺病毒載體。
在眾多的病毒基因載體中，腺病毒載體使用得最多，而且很有可能在臨床上開發應用。國內已經應用了腺病毒載體表達抑癌基因（WTBX）p53治療頭頸部腫瘤的臨床試驗，是世界上首次在人體應用病毒載體進行基因治療的大規模臨床試驗。研究顯示，表達（WTBX）p53shRNA的腺病毒載體在體內和體外均能成功地降低（WTBX）p53靶蛋白的水平。這個載體係統提高了將shRNA導入多種組織細胞的效率。但是，由於腺病毒載體在細胞內保持遊離，並且隨著細胞的分裂而稀釋，所以shRNA的表達是短暫的。腺病毒蛋白的低水平表達，以及對腺病毒蛋白的預存免疫也導致了表達shRNA的細胞數目的減少，限製了它在體內應用於導入siRNA。
13.1.3.4細菌載體
細菌作為抗瘤劑的應用已曆史悠久，早在100多年前，紐約醫生Coley就嚐試用細菌來治療腫瘤。現在人們往往采用分子生物學技術，通過基因改造的方法使細菌變得基本無毒並將外源基因導入細菌載體。實驗證明這種方法具有很大的優越性，為腫瘤的治療提供了新的思路，近來已成為腫瘤生物治療研究的熱點之一。目前認為，由於腫瘤組織內部不同於正常組織的病理生理特點和厭氧菌本身的生物學特性共同作用，使厭氧菌具有較好腫瘤靶向性，有望成為基因治療的重要載體。
沙門菌是兼性厭氧菌，在有氧及缺氧環境中均可生存，因此它在較大和較小的腫瘤內均有靶向性定植作用。Pawelek等將14028WT（4×106的菌量）的野生型鼠傷寒沙門菌通過腹腔注射至荷瘤（黑色素瘤）小鼠體內，2天後檢查發現每克瘤體組織內含有（6.5～6.8（BF））（BFQ）×109的野生鼠型沙門菌。在腫瘤組織和正常組織（肝）中的分布比例為270：（KG-2）1。而減毒株在腫瘤中的菌量為（1.2～1.7（BF））（BFQ）×109/g，在肝組織中的含量為（1.9～2.0（BF））（BFQ）×105/g，分布比例為9000：（KG-2）1。靜脈給予荷瘤（自發瘤、同種移植瘤或人異種移植瘤）鼠敲除（WTBX）msbB基因和（WTBX）purl基因的傷寒沙門菌突變株後，該菌可在腫瘤細胞外成分中富集，腫瘤組織中和在正常組織中的菌量之比為300：（KG-2）1～1000：（KG-2）1。以上研究表明鼠傷寒沙門菌減毒株較野生株具有更好的靶向性。
減毒鼠傷寒沙門菌在小鼠體內能定向有效地轉移自殺基因治療腫瘤，說明細菌有望用作基因治療載體。營養缺陷型菌株能使載體在全身給藥時富集於腫瘤組織，而具備腫瘤靶向性，並可降低細菌毒性。突變菌株對多種抗生素敏感，可避免細菌過量繁殖導致的膿毒症或菌血症。改變細菌的基因，可以降低脂多糖誘發的全身性腫瘤壞死因子產生，減小毒性，解決細菌脂質A帶來的安全性問題。研究還表明細菌能將質粒遞呈給不分裂的細胞，並在遞呈基因後被宿主細胞殺滅。減毒鼠傷寒沙門菌作為腫瘤基因治療載體，不僅能遞呈外源基因，而且本身還有抑製腫瘤生長的作用。目前細菌作為基因治療載體的實驗都是在小鼠體內完成的，載體的效力和安全性都需要經過大量的實驗研究。
（KG（0.12mm）目前認為，厭氧菌具有較好腫瘤靶向性的原因，在於腫瘤組織內部這種不同於正常組織的病理生理特點和厭氧菌本身的生物學特性共同作用的結果：①腫瘤的微環境。大多數實體腫瘤由於細胞生長迅速而血供相對不足，使瘤內存在相對缺氧，這為厭氧菌的生長和繁殖提供有利的場所。②腫瘤組織的代謝特點。由於腫瘤組織代謝旺盛，產生大量的中間代謝產物，為營養缺陷型的厭氧菌生長提供有利的條件，使腫瘤內細菌的增殖速度遠高於正常組織。③免疫逃逸。由於腫瘤組織間隙的特殊環境，使免疫成分（粒細胞、抗體、血清補體等）隨血流進入腫瘤組織，腫瘤組織成為細菌的免疫避難所，使細菌逃避了機體免疫。
以上研究表明，利用細菌特別是厭氧菌作為抗腫瘤基因載體為腫瘤的治療開辟了新的途徑，而且這些實驗在動物實驗階段取得了巨大的成功。這為我們利用細菌作為攜帶siRNA的載體提供了理論依據和可能。在利用細菌載體進行siRNA治療時，我們要解決的關鍵問題是哪一種細菌最適於攜帶siRNA，而且細菌能否同時攜帶多個針對腫瘤細胞生長不同環節的多種抗腫瘤siRNA，以達到更徹底地抑製癌細胞生長的治療目的。還有，利用細菌載體進行siRNA治療的安全性和存在問題均有待進一步深入研究。
13.2siRNA的全身應用
盡管越來越多的小動物模型實驗證明，局部導入siRNA到特定的器官已取得顯著的成功。但是，這種導入方法僅僅限於藥物容易到達的組織器官。對於深部的組織器官如淋巴結和轉移的腫瘤細胞等彌散靶點的治療，則需要采取其他治療策略。
13.2.1高壓靜脈注射法導入siRNA
首次使用siRNA導入全身應用是高壓靜脈注射法轉導，這種方法在此之前用於導入質粒DNA進入細胞內。一般通過鼠尾靜脈導入全身係統，由於鼠尾靜脈直接回流到小鼠的下腔靜脈，大量的液體通過鼠尾靜脈和下腔靜脈回流進入心髒，使鼠體內的血容量增加20%～40%，心髒在很短時間內超負荷，出現一過性的“心功能不全”，液體因此而倒流回下腔靜脈以及與下腔靜脈相連接的各腹部器官的靜脈中，結果在這些器官產生倒流性灌注的現象，把液體輸送到組織內。此時，細胞的吞噬作用大增，液體內的DNA或RNA等基因物質也被轉導進入肝、腎、脾和心肺等組織細胞內。