13.1siRNA的載體技術
13.1.1RNA的化學修飾與導入
RNA幹擾（RNAi）是目前基因治療的一個有力工具，引起基因沉默現象的siRNA需要經過適當的化學修飾才能應用於體內。經過適當的化學修飾既能穩定siRNA雙鏈，又能有效抑製靶基因的幾種常用化學修飾法，包括磷酸骨架修飾、核糖修飾和堿基修飾等。正確的修飾將會極大地促進作為藥物應用的siRNA從體外到體內、從實驗室到臨床應用的轉化，將為治療病毒性疾病、腫瘤和遺傳病開辟一條嶄新的道路。
13.1.1.1固醇類衍生物修飾siRNA
體內膽固醇及其衍生物的代謝主要在肝，因此，如果把核酸分子與膽固醇或其衍生物通過共價鍵連接在一起，肝細胞在吸收膽固醇的同時也可以把核酸分子吸收進入細胞內。利用這種方法，ManohaRNA等成功地設計了經6型膽固醇衍生物修飾的反義寡核苷酸，提高它們在肝中的生物利用度，增加反義寡核苷酸進入肝細胞的機會。
根據相同的原理，Soutschek等在化學合成siRNA雙鏈分子的時候，把6型膽固醇衍生物、膽汁酸的衍生物或月桂酸的衍生物分子通過吡咯烷共價鍵連接到siRNA分子正義鏈或反義鏈的5′端，通過體外和體內實驗觀察這些經過修飾的siRNA分子靶向導入肝細胞的功能。
此外，這些經過固醇類衍生物修飾的siRNA分子，不需要脂質體轉染便能在穩定表達指示蛋白βGal的人肝癌細胞株中高效地沉默目標基因的表達。因為使用針對HCV的siRNA序列並不能沉默βGal的表達，可見這種基因沉默有序列特異性。在所有的siRNA分子中，6型膽固醇衍生物和月桂酸衍生物修飾的βGal siRNA抑製目標基因表達的效應最強。
在大鼠的鼠尾靜脈注射目標基因的常規siRNA後進行檢測，其半衰期是6分鍾，血漿清除率是17.6ml/min，注射siRNA後24小時，在內髒已不能檢測到相關基因的siRNA。與之相比，靜脈注射膽固醇修飾的siRNA分子（CholsiRNA）後，其半衰期延長到95分鍾，血漿清除率下降至0.5ml/min，注射CholsiRNA後24小時，在肝、心、腎、脂肪組織和肺組織等內髒中可以檢測到siRNA分子，說明通過膽固醇或其衍生物修飾的siRNA分子在生物體血漿內會更加穩定，持續時間更長。
由於阿樸脂蛋白B基因參與了體內低密度脂蛋白（LDL）和內源性膽固醇的生成，在冠狀動脈心髒病的發病機製中起重要作用。如果能在體內沉默Apo B的表達，可以防止冠心病的發生和發展。因此，Soutschek等在應用CholsiRNA治療動物疾病模型的研究中，選用了Apo B作為沉默的目標基因。針對Apo B的CholsiRNA分子注射到小鼠的靜脈內，能有效地抑製肝細胞內源性的Apo B表達。這種作用是通過經典的RNA幹擾途徑進行的，也就是通過降解信使RNA分子，而且在預計的位點切割信使RNA來抑製目標基因表達。CholsiRNA分子不僅可以抑製肝細胞內源性基因的表達，在Apo B轉基因鼠中也能有效地沉默目標基因，降低外周血中的脂蛋白和膽固醇的水平，對這些小鼠的高脂和高膽固醇血症有治療作用。
這是第一個通過常規靜脈注射，靶向導入siRNA的例子，在這項研究中，不需要進行高壓鼠尾靜脈注射，經膽固醇衍生物修飾的siRNA分子能有效地被肝細胞吸收，並能抑製目標基因表達。但是，應用膽固醇修飾siRNA分子進行靶向導入，也存在著一些問題。首先，CholsiRNA隻能靶向導入一些參與了膽固醇代謝的器官，例如肝和空腸，而其他組織器官，包括惡性腫瘤的靶向導入siRNA，還需要設計更合適的方法。其次，在體內反複注射膽固醇修飾的siRNA分子，必然增加了體內膽固醇的代謝負擔，增加高膽固醇血症和高脂血症的發生機會。
膽固醇修飾的siRNA常規靜脈注射給藥後，可以穩定、高效地分布到小鼠全身組織，不產生明顯毒性效應，與組織中靶基因轉錄產生的mRNA結合並誘導其降解，進而抑製靶基因表達。這種膽固醇修飾的siRNA分子有望成為新一代治療藥物。
13.1.1.2寡聚核苷修飾siRNA
另外一種延長siRNA抑製基因表達時間的方法是對化學合成的RNA進行核苷酸修飾。盡管未經修飾的siRNA在細胞培養物或者體內的穩定性很高，然而在有些情況下，需要進一步提高siRNA的穩定性。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經過修飾的核苷。siRNA經過2個2′-O-甲基RNA修飾5′端、4個甲基化核苷修飾3′端後，與序列相同但是未經修飾的siRNA相比活性相同，但是在細胞培養物中引起基因沉默現象的時間延長。然而，增加siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導致siRNA活性下降。
對siRNA最重要的修飾是對核苷酸戊糖2′-羥基（2′-OH）的修飾。2′-OH是RNA與DNA的主要區別，RNA水解時，在RNA酶催化下，2′-OH先攻擊磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環狀磷酸二酯，再在堿的作用下形成水解產物。在核糖的2′位置引入某些取代基團如甲基、氟後，使siRNA具有更強的抵抗核酸酶水解的性能。但也有實驗結果顯示，2′-OH對RNA幹擾的效果並不重要，認為siRNA與mRNA形成的雙鏈結構是誘導RNAi的重要因素。單純正義鏈、單純反義鏈和雙鏈的核糖修飾都明顯抑製了靶基因的表達。
在siRNA戊糖的2′位置引入烷基是核糖修飾的一種，如2′-O-甲基。但並不是甲基化越多越好，siRNA任何一條鏈的核苷酸如果全部甲基化將導致siRNA失去基因沉默的活性，故一般隻對2條鏈的末端核苷酸進行甲基化。但是，並不是修飾的核苷酸越多越好，體外實驗證明，3′端最多修飾4個核苷酸有效，而在一個5′端有2個甲基化核苷酸和3′端有4個甲基化核苷酸的siRNA與未經修飾的siRNA比較，兩者抑製基因表達的活性基本相同，但引起基因沉默現象的時間延長。3′端可以耐受各種類型的修飾，但隨著siRNA甲基化核苷酸的數目增多，其RNA幹擾的活性也隨著逐漸下降。
另一種核糖修飾是將siRNA上嘧啶核苷酸的2′-OH用2′-F替代，2′-F使RNA酶不易識別siRNA，從而增強了siRNA的穩定性。研究證明，siRNA上嘧啶核苷酸的2′-OH保持不變，與用2′-F替代後的siRNA相比較，1分鍾內有一半以上的2′-OH siRNA降解，4小時後全部降解。而2′-F siRNA在24小時後50%以上仍保持完整，48小時後25%的2′-F siRNA保持完整。細胞轉染試驗和小鼠體內試驗發現2′-F siRNA與2′-OH siRNA的基因沉默效應無明顯差別。可見，2′-F修飾使siRNA的穩定性增加，而且雙鏈2′-F siRNA的穩定性最強，無論修飾或未修飾的單鏈siRNA都沒有雙鏈siRNA穩定。修飾和未修飾的siRNA最強的RNA抑製效應均出現在細胞轉染後42小時，對靶基因EGFP表達的最大抑製率均在85%～90%，但66～120小時時2′-F siRNA的基因沉默效應比2′-OH siRNA作用強。轉染後120小時2′-FsiRNA對EGFP表達的抑製率仍達80%，而2′-OH siRNA抑製率僅為40%。
可見，經過寡聚核苷修飾後，siRNA的穩定性增強，引起的靶基因沉默現象的時間延長，發揮了更強的抑製靶基因表達效應。
13.1.2非生物載體
13.1.2.1脂質體技術
脂質體最初是由英國學者Bangham和Standish將磷脂分散在水中進行電鏡觀察時發現的。磷脂分散在水中自然形成多層囊泡，每層均為脂質的雙分子層；囊泡中央和各層之間被水相隔開，雙分子層厚度約為4nm。後來，將這種具有類似生物膜結構的雙分子小囊稱為脂質體。1971年英國萊門等人開始將脂質體用於作為藥物載體。