②堿鹽水法:樹脂用蒸餾水洗後，用5～6柱床體積pH 12.0、1.1mol/L NaCl(約400L)洗滌至用2倍乙醇檢查無沉澱生成為止，流速每小時1柱床體積。用1～2柱床體積蒸餾水洗至近中性，最後用1柱床體積3mol/L NaCl洗脫，流速每小時0.2～0.25柱床體積。收集對天青染料顯紫色反應的部分。
上述兩法中，洗滌液一般含肝素1～2IU/mL，洗脫液中含肝素400～600IU/mL。
（4）乙醇沉澱於3mol/L NaCl的洗脫液(約70L)，加1～2倍95%乙醇沉澱，同時攪拌10～30min，放置4～8h或過夜。虹吸除去上層清液，沉澱轉入3或4號垂熔玻璃漏鬥中過濾收集。也可采用離心方法分離。沉澱加蒸餾水約1.5～2L溶解，過濾至澄清。用6mol/L HCl調pH為2.0～2.5，再抽濾至澄清。用2mol/L NaOH調回pH為6.0～7.0。補加3mol/L NaCl和蒸餾水至6～9L，使鹽濃度為1mol/L，再加1～2倍乙醇沉澱。沉澱用3∶1或5∶1醇-水浸泡兩次，95%乙醇洗一次，丙酮洗兩次，45℃真空幹燥4～6h，即得成品150～200g，效價約150～170IU/mg，收率為30000IU/kg腸黏膜。
（五）說明與討論
①根據目前國內外的情況，肝素的生產工藝，以離子交換樹脂法為好。
②動態吸附和洗脫有利於提高收率和效價。問題是經酶解或鹽解後的提取液要澄清才能上柱。這就要改進酶解或鹽解的方法，並在分離的機械上加以研究。國外有的廠在酶解後加矽砂助濾通過板框壓濾後上柱。
③要取各工藝之長，精益求精。可進一步研究更適合的樹脂，專供生產肝素用。用含適量的HCl或NaOH的NaCl溶液洗脫其他黏多糖，進行分級分離是較好的方法，可結合其他條件進一步研究，廣泛使用。
④用乙醇分級分離應嚴格掌握濃度。要得到高效價的產品，乙醇濃度可稍低而不能偏高。掌握好洗脫方法和乙醇濃度是提高效價的關鍵。
⑤有關步驟中凡屬雜質的沉澱(如精製時調酸性產生的沉澱)都應分離除淨，這與提高效價關係也很大。要在助濾劑和分離機械方麵進一步研究，使達到既能徹底分離又能提高效率的目的。
⑥氧化法精製，以高錳酸鉀為氧化劑，在工藝條件下氧化能力較強，但可能使產品含鉀量偏高並影響收率；以過氧化氫為氧化劑，在工藝條件下較為溫和，且不增添雜質。兩者配合使用，可獲較理想的效果。
（六）肝素質量標準與檢驗方法
1.效價測定法簡介
肝素是一種天然活性物質，其活性不能用化學或物理的方法進行準確測定，隻能采用生物檢定法測定。不同國家及不同時期采用的方法不同，製定的標準也不同。1923年，Howell對肝素活性單位的定義是：在0℃恰好使新鮮貓動脈血1mL在24h內不發生凝結所需肝素的量為1個活性單位。1939年，Reinert等介紹用檸檬酸鈉抗凝的牛血漿為底物進行測定，其抗凝血活性單位定義為：在37℃恰能抑製再鈣化牛血漿1mL於4h內發生凝結所需肝素的量。後來世界各國根據以上兩種活性單位定義的方法而加以改進成為藥典現在所采用的方法。
（1）中國藥典方法《中國藥典》2005年版第二部270頁現采用兔全血法。本法係將肝素標準品和供試品用健康家兔新鮮血液比較兩者延長凝結時間的程度，以決定供試品效價的一種方法。抽取兔的全血，立即加到一係列含有不同量肝素的試管中，不另外加其他任何物質。使血液與肝素混勻後，觀察其凝結時間。肝素的活性越大，血凝結時間越長，並具有一定的相互關係。
還采用了兔或豬血漿法，即將檸檬酸鈉抗凝的血漿置試管中保溫後，再於其中加入標準品或供試品及氯化鈣，觀察其凝結時間。
（2）美國藥典方法美國藥典從第xIV版開始收載基於Reinert而改進的方法，即羊血漿法。將檸檬酸鈉抗凝的羊血漿，加於標準品和供試品溶液，重鈣化後37℃保溫1h，觀察標準品和供試品肝素試管的凝固程度。如果標準品和供試品配成相同的濃度又得到相同的凝固程度，則說明它們的效價也相同，以此來對比測定未知樣品的效價。
（3）英國藥典和歐洲藥典方法1983年以後，英國藥典采用了歐洲藥典的方法，該基本原理也是觀察在一定條件下供試品與標準品對檸檬酸鈉抗凝羊血漿重鈣化後的凝固程度，來判斷供試品的效價。所不同的是，它嚴格規定了羊血漿的收集方法，並與高嶺土和腦磷脂準確保溫2min後再鈣化。該法消除了美國藥典法中不同實驗室甚至不同批次的樣品測定結果重現性差的缺點。
（4）生色底物法該法的原理是根據肝素與抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的複合物對Xa因子(FXa)或凝血酶(FⅡa)的抑製作用而進行測定的。殘餘的FXa或FⅡa可用某些底物測出，其量與肝素呈負相關。
在405nm處測定吸收度，即可算出肝素的含量。
（5）染料比色法含堿基的堿性染料(天青A、甲苯胺藍等)有一定最大吸收，如天青A在pH 3.5時的最大吸收在620nm處，結合了肝素後，則最大吸收向短波移動，在以巴比妥為緩衝液和以西黃吾膠為保護膠體下，產物在505nm處有最大吸收，且與肝素濃度成正比，測定該波長下的吸收度可以根據標準曲線計算出肝素的含量。該法隻能用於估計效價和生產過程的控製，因沒有生物活性的變性肝素也有此反應。
2.生物核定用標準品
為求得不同實驗室測定結果的一致性，人們用一定的標準品進行對比以求得供試品的效價。目前國內使用的標準品是由中國藥品生物製品檢定所頒發的標準品，不同批號效價不完全一樣，多為170IU/mg左右。國外使用的標準品有第四次國際標準品，它是來自豬腸黏膜肝素，每安瓿效價為1780IU。另外，美國藥典和歐洲藥典都有自己的標準品。目前美國藥典標準品是USP-K-3標準品，每安瓿效價為356USPU。歐洲藥典標準品與第四次國際標準品沒有差別。
由於測定方法和標準品的差別，同一樣品用不同方法測得的結果不一樣，用中國藥典法測得的效價比用美國藥典法測得的效價約高10%，而美國藥典法測得的結果比世界衛生組織(WHO)規定的值低7%左右。另外，樣品的組織來源和相對分子質量的不同，測定結果也不一樣。例如，用肺肝素為標準品去測定腸黏膜肝素時，結果差別較大。同樣，用未分級肝素作標準品去測定低分子肝素時則差別更大。
3.檢驗
各國藥典對肝素效價規定的檢查項目大同小異，除酸堿度、幹燥失重、熾灼殘渣、鉀鹽、重金屬、熱原外，還要檢查溶液的澄清度與顏色；溶液在260nm波長處的吸收度以控製核酸類雜質；在280nm處的吸收度以控製雜蛋白；黏度以控製黏多糖雜質；總氮量以控製含氮雜質等。
四、冠心舒
冠心舒是從哺乳動物十二指腸中提取得到的類肝素物質，國外稱作Ateroid，同類產品還有Asclero、Vesel等產品，國內統稱冠心舒。藥理實驗證明，這類物質具有降低心肌耗氧量、減少動脈粥樣硬化斑塊的作用。臨床觀察表明，對改善或消除心絞痛、心悸、胸悶、氣短有較明顯的療效。適用於動脈粥樣硬化性心髒疾病。另外對腦血管疾病也有效果。
（一）化學成分和性質
通過對冠心舒成分分析，得出其化學成分主要為氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基半乳糖和葡萄糖等。有資料顯示，采用離子交換法和季銨鹽沉澱法對冠心舒進行分離，可以得出兩種主要組分。組分Ⅰ為中性或近中性，組分Ⅱ為酸性黏多糖。對組分Ⅱ還可以進行進一步分離，得到性質不同的類肝素，其中含有透明質酸、硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素等。
冠心舒呈白色或類白色的無定形粉末，味微鹹，無臭，有引濕性，在水中能部分溶解呈渾濁狀，不溶於乙醇、乙醚和丙酮。以氨基葡萄糖計算其黏多糖含量應為15%以上。
（二）製備方法
1.工藝流程2.工藝要點
（1）提取、中和、濃縮豬十二指腸用水衝洗，修去附著脂肪，絞碎成漿狀。加4倍量水，攪拌下緩緩加入HCl，使pH至2.5～3.0，攪拌提取10h。靜置沉澱，虹吸上清液，下層沉澱過濾後重複提取過程，用水量為2倍量。合並提取液，用0.4g/mL NaOH溶液調pH至中性。中性液體加熱煮沸，除去上浮雜質，靜置片刻，將液體移入濃縮罐，減壓濃縮至原體積1/2。
（2）酶解將濃縮液冷至40℃以下，稱重後加入0.35%苯酚，用0.4g/mL NaOH調pH至8.0～8.5，按原料量加胰酶粉（活力：1∶200）0.2%，在35～40℃下酶水解48h。
（3）變性除雜蛋白、脫脂酶解液用冰醋酸調pH至6.0～6.5，加熱至90℃，保溫10min，冷卻靜置12h後過濾。濾液減壓濃縮至原體積1/3。冷卻後過濾，加入1/2倍量的汽油，振搖10min，置分液器中靜置，分出下層液。同樣1/3倍量汽油再處理一次，合並下層脫脂液，液體減壓濃縮至原料量1/4時過濾。
（4）沉澱濃縮濾液加入乙醇，使乙醇含量達60%～65%，靜置沉澱，去上清液。沉澱加入溶解，加水量為原濃縮液的4/5，布袋過濾，濾液在攪拌下，緩緩加入乙醇,使乙醇含量達60%～65%，靜置沉澱，去上清液，得冠心舒濕品。
（5）脫水、幹燥沉澱物以3倍量的乙醇浸泡24h，分離後再以沉澱物3倍量乙醇浸泡24h，抽幹，60～65℃真空幹燥。
3.製劑配料
每10萬片成品的成分如下：冠心舒粉1.0kg，糖粉1.5kg，澱粉7.4kg，硬脂酸鎂0.1kg。
（三）冠心舒質量標準與檢驗方法
冠心舒產品的質量標準與檢驗方法參考《中國藥典》2005版第一部669頁及附錄ID690頁中相關內容。