（三）激肽釋放酶質量標準與檢驗方法
激肽釋放酶在國內現行質量標準參考《化藥部頒標準》第E6-111頁。
1.質量標準
成品為白色或灰白色粉末，溶於水或生理鹽水中成微黃色澄清溶液。注射用血管舒緩素效價每毫克不得少於10 IU，口服用每毫克不得少於5 IU。
酸度：1.5mL含10個單位的水溶液pH應為4.5～7.0。
熱原：取成品適量，加無熱原蒸餾水溶解，配成2IU/mL的溶液，按熱原檢查法檢查，劑量按家兔體重每千克靜脈注射1mL。
2.活力測定
激肽釋放酶的效價測定，過去采用釋放激肽使狗(或貓)血壓下降的生物活力測定法，後改用分光光度法測定酶對合成底物的酯解活力。其方法參見《中國藥典》。
（四）臨床用途
本品有舒展毛細管和小動脈作用，使冠狀動脈、腦、視網膜等處的血流供應量增加，適用於高血壓、冠狀血管及動脈血管硬化等症；對心絞痛、血管痙攣、肢端感覺異常、凍瘡等症有減輕症狀作用。
六、胰島素
1922年從胰髒中提取得到一種較純的降血糖物質，命名為胰島素。1923年開始供應臨床使用。迄今胰島素仍為治療糖尿病的特效藥物。1926年製得的胰島素結晶，是第一個有生物活性的蛋白質結晶，1955年闡明了胰島素的一級結構。我國在1965年完成了牛結晶胰島素的全合成工作，並具有與天然牛結晶胰島素相同的生物活性。胰島素是世界上第一個人工合成的蛋白質。
胰島素廣泛存在於人和動物的胰髒中，正常人的胰髒有200萬個胰島，占胰髒總重量的1.5%。胰島由α-、β-和δ-三種細胞組成，其中β-細胞製造胰島素、α-細胞製造高血糖素和胰抗脂肝素、δ-細胞製造生長激素抑製因子。在β-細胞中開始是以活性很弱的前體胰島素原存在，進而分解為胰島素而進入血液循環。
（一）結構和性質
胰島素是一種相對分子質量較小的蛋白質，由51個氨基酸組成，有A和B兩鏈，A鏈含21個氨基酸殘基，B鏈含30個氨基酸殘基，兩鏈之間由兩個二硫鍵相連，在A鏈本身還有一個二硫鍵。不同種屬動物的胰島素分子結構大致相同，主要差別在A鏈二硫橋中間的第8，9和10位上的三個氨基酸和B鏈C末端的一個氨基酸，它們隨種屬而異，但它們的生理功能是相同的。目前已有20多個(種屬)胰島素結構被闡明。我國繼人工合成牛結晶胰島素後，就開始胰島素結構的研究工作，借助X-射線衍射分析，繪製出胰島素的空間結構圖。
胰島素為白色或類白色粉末結晶，由於精製方法不同，在顯微鏡下觀察，可分兩種形態，一種為不規則細微顆粒，稱“無定形”，另一種為扁斜形六麵體。根據化學結構分析，牛胰島素分子質量為5733u，豬為5764u，人為5784u。
胰島素的等電點為5.30～5.35。因蛋白質的等電點隨溶液的離子強度及離子性質不同而有所改變，因此在生產實踐中分離、精製或結晶時采用的等電點並不一定正好在此值。胰島素在pH 4.5～6.5範圍內，幾乎不溶於水，在室溫下溶解度為10μg/mL；易溶於稀酸或稀堿溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解，在90%以上乙醇或80%以上丙酮中難溶；在乙醚中不溶。胰島素在弱酸性水溶液或混懸在中性緩衝液中較為穩定，在堿性溶液中易水解而失活，溫度升高時失活更快。在pH 8.6時，溶液煮沸10min即失活一半，而在0.25%硫酸溶液中要煮沸60min才能導致同等程度的失活。
在水溶液中胰島素分子隨pH、溫度、離子強度的影響產生聚合和解聚現象。在低胰島素濃度的酸性溶液(pH≤2.0)時呈單體狀態。鋅胰島素在pH為2.0的水溶液中呈二聚體，聚合作用隨pH增高而增加，在pH 4.0～7.0時聚合成不溶解狀態的無定形沉澱。在高濃度鋅的溶液中，pH 6.0～8.0時胰島素溶解度急劇下降。鋅胰島素在pH 7.0～9.0時呈六聚體或八聚體，pH＞9.0時則解聚並由於單體結構改變而失活。在pH為2.0的酸性水溶液中加熱至80～100℃。可發生聚合而轉變為無活性纖維狀胰島素。如及時用冷0.05mol/L NaOH處理，仍可變為結晶形有活性的胰島素。胰島素具有蛋白質的各種特殊反應，高濃度的鹽，如飽和氯化鈉、半飽和硫酸銨等可使其沉澱析出；也能被蛋白質沉澱劑如三氯醋酸等沉澱；並有茚三酮、雙縮脲等蛋白質的顯色反應。
胰島素能被胰島素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解而失活。因此胰島素通常隻能注射給藥。即使這樣，在血液和組織中也能被水解，所以藥物作用時間較短。當與魚精蛋白或珠蛋白形成複合物或製成難溶解的結晶，即能延長藥效。
還原劑如硫化氫、甲酸、醛、醋酐、硫代硫酸鈉、維生素C及多數重金屬(除鋅、鉻、鈷、鎳、銀、金外)都能使胰島素失活。胰島素對高能輻射非常敏感，容易失活；紫外線能破壞胱氨酸和酪氨酸結構。光氧化作用能導致分子中組氨酸破壞。超聲波能引起其非專一性降解。胰島素能被活性炭、白陶土、氫氧化鋁、磷酸鈣、CM-C和DEAE-C吸附。
（二）加工工藝
生產胰島素的方法較多，比較成熟且目前被普遍采用的是酸醇提取減壓濃縮法。還有分級提取鋅沉澱法和磷酸鈣凝膠吸附法也開始用於工業生產。
1.酸醇提取減壓濃縮法
（1）工藝流程
（2）精製工藝流程
2.工藝要點
（1）提取凍胰塊用刨胰機刨碎後加入2.3～2.6倍的質量分數86%～88%乙醇和5%草酸，在10～15℃攪拌提取3h。離心，濾渣再用1倍量68%～70%乙醇和0.4%草酸提取2h，同上法分離之。乙醇提取液合並。
（2）堿化、酸化提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調pH 8.0～8.4(液溫10～15℃)，立即進行壓濾，除去堿性蛋白，濾液應澄清，並及時用硫酸調pH至3.6～3.8，降溫至5℃，靜置不少於4h，使酸性蛋白充分沉澱。
（3）減壓收縮吸上層清液至減壓濃縮鍋內，下層用帆布過濾，沉澱物棄去。濾液並入上清液，在30℃以下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液相對密度為1.04～1.06(約為原體積的1/9～1/10)為止。
（4）脫脂、鹽析濃縮液轉入去脂鍋內於5min內加熱至50℃後，立即用冰鹽水降溫至5℃，靜置3～4h，分離出下層清液(脂層可回收胰島素)。調pH 2.3～2.5於20～25℃在攪拌下按0.27g/mL的量加入固體NaCl，保溫靜置數小時。析出的鹽析物即為胰島素粗品。
（5）精製
①除酸性蛋白：鹽析物按幹重計算，加入7倍量蒸餾水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol/L氨水調pH 4.2～4.3，然後補加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例為7∶3，充分攪拌後，低溫放置過夜，使溶液冷至5℃以下，次日在低溫下離心分離，或用過濾法將其沉澱分離。
②鋅沉澱：在濾液中加入4mol/L氨水使pH為6.2～6.4，加入濾液體積3.6%的醋酸鋅溶液(濃度為0.2g/mL），再用4mol/L氨水調節pH至6.0，低溫放置過夜，次日過濾，分離沉澱。
③結晶:將沉澱過濾，用冷丙酮洗滌，得幹品(每千克胰髒得0.1～0.125g幹品)，再按幹品重每克加冰冷20g/L檸檬酸50mL、65g/L醋酸鋅溶液2mL，丙酮16mL，並用冰水稀釋至100mL，使充分溶解，冷到5℃以下，用4mol/L氨水調pH8.0，迅速過濾、濾液立即用10%檸檬酸溶液調pH6.0，補加丙酮，使整個溶液體係保持丙酮含量為16%，攪拌使結晶析出。在顯微鏡下觀察，外形為似正方形或扁斜形六麵體結晶，再轉入5℃左右低溫室放置3～4d，使結晶完全。結晶離心收集，並小心刷去上層灰黃色無定形沉澱，用蒸餾水或醋酸銨緩衝液洗滌，再用丙酮、乙醚脫水，離心後，在五氧化二磷真空幹燥箱中幹燥，即得結晶胰島素，效價應在25IU/mg以上。
（6）回收
①pH4.2沉澱回收:取pH 4.2沉澱，用7倍量冷蒸餾水攪勻(包括沉澱中所含的水，按50%計)，用2mol/L HCl調pH為2.5，再加3倍量(按幹品計)冷丙酮，攪拌溶解後用2mol/L氨水調pH為4.2～4.3，然後補加丙酮至30%，冰箱過夜。次日在5℃以下過濾，濾液用2mol/L氨水調pH至6.2，按體積每100mL 0.2g/mL醋酸鋅1.8mL，再以2mol/L氨水調pH6.0，低溫放置過夜，次日過濾，分離沉澱。下麵操作按胰島素精製③結晶進行。
②pH6.0鋅沉澱母液回收(包括pH8.0沉澱)：用2mol/L氨水將母液調至pH7.0，冰箱放置2～3h(pH7.0時，溶液中的Zn2+成為Zn(OH)2，可吸附胰島素共同沉澱出)，沉澱物收集後加酸水調pH2.5溶解；pH8.0沉澱的回收可用4mol/L HCl溶解並調pH2.5，在這裏合並，過濾，濾液用2mol/L氨水調pH5.25～5.30，放置過夜，過濾沉澱物，按10g濕重折算1g幹重進行結晶，按精製②操作進行。
③無定形沉澱回收:沉澱物按1/2計算，每克加20g/L檸檬酸50mL、丙酮16mL、65g/L醋酸鋅2mL，加水稀釋至100mL，使溶解。以下操作同“（5）精製中③”。
④pH 6.0結晶母液回收:結晶母液用2mol/L HCl調至2.5左右，按體積加2倍粗製時鹽析後的飽和鹽水，放置6～7h後，過濾並抽幹。按此鹽析物重加10倍量蒸餾水溶解，加入溶液體積2%～10%的0.2g/mL醋酸鋅溶液，用2mol/L氨水調pH為5.2～5.3，過濾，沉澱稱重後再以10倍量蒸餾水用2mol/L HCl調pH 2.5溶解，再用2mol/L氨水調等電點pH 5.2～5.3，經上述反複三次後，沉澱按濕品1/10計進行結晶，但堿化工序改為pH 6.8，酸化改為pH 6.4時析出結晶。
亦可在得到鹽析物後下麵操作同正品，隻是按鋅沉澱濕品1/10計算進行結晶。
⑤油脂回收：油脂1份加水1份，按油脂重的3%加NaCl，不斷攪拌加溫到50℃，再靜置降溫至5℃分出油脂，然後對溶液進行鹽析，得鹽析物。其他操作與正品精製相同。
上述各項操作，以pH4.2沉澱回收得量最多，占整個回收量的近一半，約為正品的10%，其他pH 6.0結晶母液回收和油脂鹽析物回收也分別達正品的5%左右。
（三）分級提取直接鋅鹽沉澱法
1.工藝原理
根據胰島素易與鋅離子結合的特性，用氯化鋅作沉澱劑，可使胰島素直接從初步除去堿性和酸性雜蛋白的提取液中沉澱析出。由於草酸根可與鋅離子絡合，幹擾胰島素的沉澱，故提取時不采用草酸而改用硫酸和鹽酸。為減少含鋅量，進行兩次氯化鈉鹽析。粗品按一般精製方法處理。
2.工藝流程
3.工藝要點
（1）提取將凍胰用刨胰機刨碎，每100kg胰髒加入300L 82%乙醇，在10～12℃加入12mol/L H2SO4，調節pH2.8～3.0，攪拌提取0.5h。加入6mol/L HCl調pH至2.0，繼續攪拌提取2.5h，分離殘渣，殘渣加入65%乙醇150L，用6mol/L HCl調節pH 2.0，10～12℃攪拌提取2h，分離殘渣。合並兩次提取液。
（2）堿化提取液冷至0～5℃，用濃氨水調pH至7.8～8.0，加入矽藻土(每100kg胰髒加6kg)，板框壓濾，隨即用混合酸(HCl 400mL，H2SO41000mL，水4000mL)酸化至pH2.5，待沉澱完全後虹吸清液，吊濾，除去沉澱，溫度控製在0～3℃。
（3）第一次鋅沉澱清液加入ZnCl2溶液(每100mL胰髒加3mL ZnCl2溶液，先配成30%～50%溶液，用6mol/L HCl調節pH 2.5加入)，溫度2～4℃，待沉澱完全後，虹吸清液，吊濾除去沉澱，清液用濃氨水調pH至6.8～7.0，於5℃過夜。
（4）脫脂、鹽析虹吸除去清液，沉澱過濾收集，溶於5倍量蒸餾水，用6mol/L HCl調pH 2.7～2.8，12～15℃放置。次日放出下層清液(上層脂肪再用5倍量蒸餾水洗滌，回收下層清液，作下批鋅沉澱溶解用)，清液用6mol/L HCl調pH2.5，在溫度25℃加0.27g/mL NaCl鹽析。所得第一次鹽析物溶於20倍量蒸餾水中用6mol/L HCl調pH至2.5，再加0.16g/mL NaCl鹽析，過濾，收集第二次鹽析物。
（5）30%丙酮分級沉澱、第二次鋅沉澱鹽析物溶於7倍量水中，加入3倍量丙酮，用4mol/L氨水調pH4.5，冷至0～5℃過夜，除去沉澱(沉澱另行回收)，清液用4mol/L氨水調pH6.0，加入0.2g/mL醋酸鋅(按每100kg投料加入30mL)，析出白色沉澱。
（6）結晶過濾收集沉澱，按下列配方結晶(按每100kg投料所得沉澱物計)：2%檸檬酸500mL；20%醋酸鋅6.5mL，丙酮160mL；蒸餾水稀釋至1000mL。結晶液冷卻至0～5℃，用4mol/L氨水堿化至pH 8.0，過濾除去沉澱。用0.1g/mL檸檬酸調節pH 6.0，攪拌結晶2d，虹吸除去清液，離心，收集結晶，用蒸餾水洗2次，丙酮洗2次，以五氧化二磷真空幹燥，得成品。
4.說明與討論
①本工藝特點，是利用ZnCl2和胰島素形成鋅鹽沉澱，從而去掉了濃縮工序。本工藝與酸醇提取減壓濃縮法對比，可提高總收率近50%。本工藝存在周期較長和產品純度偏低的缺點，若適當改進，是一種較好的生產工藝。
②HCl對胰島素提取有利，但易使組織膠化，造成過濾困難。單用H2SO4雖能克服膠化現象，但提取量低，而且H2SO4用量大，在加入ZnCl2時則生成在乙醇中溶解度較小的ZnSO4，使鋅離子消耗，故采用兩種酸結合使用的方法，即先以H2SO4酸化，後用HCl校正和維持其提取時的pH。
③當用草酸酸化提取時，堿化後生成在乙醇中難溶解的草酸銨，有助濾作用，而改用H2SO4和HCl時，堿化後過濾困難，必須添加矽藻土作助濾劑。
（四）胰島素的其他生產方法
1.磷酸鈣凝膠吸附法
磷酸鈣凝膠具有吸附胰島素的性能，向磷酸乙醇提取液中加入氯化鈣，利用生成的磷酸鈣凝膠將胰島素吸附，然後用酸性水將胰島素溶解下來，溶液再用氯化鈉鹽析，即得胰島素粗品。磷酸鈣吸附法具有生產設備要求簡便等優點，也能得到很好的收率，用於工業化生產，目前正在進一步完善中。
2.DEAE-纖維素吸附法
該法是將胰髒的酸醇提取液除去堿性蛋白，經離子交換樹脂調pH 5.7～6.0後，濾液按1kg投料加20g已用0.1mol/L磷酸鈉緩衝液平衡過的DEAE-纖維素，攪拌吸附3h，然後用0.3mol/L HCl解吸，解吸液用10mol/L NaOH調pH2.5～3.0後，加入0.25g/mL NaCl鹽析即可得到粗製胰島素。
3.離子交換樹脂吸附法
該法是選用含磺酸基的大孔陽離子樹脂吸附，用pH 5～5.3醋酸銨醇溶液洗滌後，再用含醇15%～20%和0.2mol/L NH4Cl緩衝液(pH9.4～9.6)解吸，據報道可提高收率20%～40%。
用吸附法生產胰島素，可省去濃縮所需機械設備。研究和篩選專一性較強的大孔樹脂，將是簡化和改革工藝的一個方麵。
（五）胰島素質量標準與檢驗方法
1.質量標準
胰島素的產品指標應符合《中國藥典》2005年版第二部623頁要求。
（1）胰島素注射液胰島素注射液應符合《中國藥典》2005年版623頁的各項指標。
（2）精蛋白鋅胰島素注射液精蛋白鋅胰島素注射液應符合《中國藥典》2005年版第二部623頁的各項指標。
精蛋白鋅胰島素注射液延緩作用的檢查，是用家兔比較胰島素標準品與供試品兩者降低血糖情況，以決定供試品延緩使用是否合乎規定的一種方法。效價測定仍為小白鼠驚厥法，10mL含400IU、800IU。
2. 檢驗方法
胰島素注射液的效價測定，參見《中國藥典》2005年版第二部623頁及附錄ⅫG的方法。