牛糜蛋白酶原是由245個氨基酸殘基組成的單一肽鏈，分子中有五對雙硫鍵。激活後失去兩個二肽(絲14—精15以及蘇147—天冬酰胺148），形成由三條肽鏈組成的α-糜蛋白酶。
注射用α-糜蛋白酶是由牛胰提取的結晶藥用純酶。
（一）性質
①結晶α-糜蛋白酶為斜方形六麵體結構，分子質量24300u，等電點為pH 8.6，最適pH隨底物而異，以酪蛋白為底物時最適pH為8.0～9.0。
②α-糜蛋白酶的活性中心氨基酸殘基為組37、天102、絲195，作用於蛋白質時，優先水解L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的羧基所形成的肽鍵。
③易溶於水，不溶於有機溶劑，水中不穩定，在0.1mol/L HCl中迅速失活，在0.025mol/L HCl中的失活情況隨溫度升高而增加。
（二）加工工藝
在牛胰提取胰蛋白酶工藝中，可獲得糜蛋白酶原粗品，由糜蛋白酶原粗品可繼續製取α-糜蛋白酶，工藝路線如下。
1.工藝流程
2.工藝要點
（1）激活以糜蛋白酶原粗製品為原料。稱取糜蛋白酶原結晶，按其重加入3倍量冰冷蒸餾水，並滴加少量0.125mol/L H2SO4溶解；然後加入1倍量pH7.6，0.5mol/L磷酸緩衝液及與所加入2.5mol/L H2SO4相當量的NaOH，使pH穩定在7.6，再加入少量胰蛋白酶(每100g糜蛋白酶原，用活力為150IU以上的胰蛋白酶5mg)，置5℃冰箱中激活48h。
（2）鹽析、結晶用0.5mol/L H2SO4調pH至4.0，加入固體硫酸銨(0.5kg/L溶液)即有沉澱析出，放置2h後用布氏濾鬥減壓過濾，棄去濾液(可回收部分結晶)。取以上沉澱物稱其重加入3/4倍量0.005mol/L H2SO4使其溶解，所得溶液用酸洗，用滑石粉助濾至清。加入少量α-糜蛋白酶晶種，在20～25℃放置24h，即有大量結晶形成，用布氏漏鬥抽濾至幹。
（3）透析將上述結晶加入2.5倍量重蒸餾水，並滴加0.005mol/L H2SO4使溶解，裝入透析袋懸於水浴中，使內外溶液在同一水平線上，於5℃冰箱中或冷室中用自來水連續透析48～72h(直至透析液用BaCl2試劑檢查無顯著沉澱即可)。
（4）凍幹將透析袋內溶液用滑石粉助濾至清，然後進行除菌過濾，冷凍幹燥，即得成品α-糜蛋白酶。
3.技術關鍵
①將原料放入0.125mol/L H2SO4的目的是防止胰蛋白酶激活作用。酶原在此pH下較穩定。如在中性或偏堿性條件中放置，酶被激活後，就不能獲得酶原晶體。
②先製成酶原後再加少量胰蛋白酶激活，是製取高純度糜蛋白酶的手段。
③操作全過程都應在5℃以下進行，以防止酶的失活。
（三）α-糜蛋白酶質量標準與檢驗方法
1.質量標準
α-糜蛋白酶效價按幹燥品計算，不得低於800IU/mg。質量標準參照《中國藥典》2005年版第二部887頁。α-糜蛋白酶各項指標。
2.酶活力檢驗
酶活力單位定義：α-糜蛋白酶在37℃，pH 7.5作用於酪蛋白，在一定條件下每分鍾產生相當1μg酪氨酸，稱一個活力單位。測定方法見國家藥典方法。
（四）臨床應用
α-糜蛋白酶的作用與胰蛋白酶相似，其主要用途為：
外科：創傷或手術後創口愈合，抗炎及防止局部水腫、血腫、關節淤血、扭傷血腫、乳房手術後浮腫等；
眼科：手術時使水晶體韌帶鬆解，而對眼內其他部位不起破壞作用，適用於白內障摘除術；
耳鼻喉科：中耳炎、鼻竇炎、咽喉炎。
四、彈性蛋白酶（彈性酶）
彈性蛋白酶(Elastase EC 3.4.4.7)，又稱胰肽酶E，是一種肽鏈內切酶，廣泛存在於哺乳動物胰髒。根據它水解彈性蛋白的專一性又稱為彈性水解酶。胰彈性酶原合成於胰髒的腺泡組織(Micin)，經胰蛋白酶或腸激酶激活後才成為活性酶。人胰每克含0.3～6.2IU彈性蛋白酶，牛、豬胰的彈性蛋白酶含量大約高達5倍。豬胰蛋白酶1-300(Trypsin 1-300)含彈性蛋白酶360IU/g。
（一）組成和結構
純彈性蛋白酶是由240個氨基酸殘基組成的單一肽鏈，分子有四對雙硫鏈。彈性蛋白酶分子的一級結構及四級結構均已清楚。其肽鏈走向和空間構型與糜蛋白酶極為相似。在pH 5.0時分子呈球型，分子內有兩個α-螺旋區，大小為5.5nm×4.0nm×3.8nm。彈性蛋白酶是一種單純蛋白酶，不含輔基和金屬離子，也無變構中心，其活力取決於特異的三維結構。活性中心氨基酸殘基為His45，Asp93，Ser88。其反應性絲氨酸附近的氨基酸殘基排列順序為：
（二）理化性質
彈性蛋白酶為白色針狀結晶，分子質量為25900u，等電點為pH 9.5。其最適pH隨緩衝體也略異，通常為pH 7.4～10.3，在0.1mol/L H2CO3緩衝液中為8.8。光吸收係數；。沉降常數S20,w=2.6S，擴散常數。
結晶彈性蛋白酶難溶於水，電泳純的彈性蛋白酶易溶於水和稀鹽溶液(可達50mg/mL)，在pH 4.5以下溶解度較小，增加pH可以增加溶解度。
彈性蛋白酶在pH 4.0～10.5、2℃較穩定，pH＜6.0穩定性有所增加，凍幹粉於5℃可保存6～12個月，在-10℃保存更為穩定。
彈性蛋白唯有彈性蛋白酶才能水解。彈性蛋白酶除能水解彈性蛋白外還可水解血紅蛋白、血纖維蛋白等，但對毛發角蛋白不起作用。許多抑製劑能使彈性蛋白酶活力降低或消失，如硫酸銅、氯化鈉、氰化鈉、硫酸銨、氯化鉀、三氯化磷。上述抑製作用一般多為可逆。另外大豆胰蛋白酶抑製劑、血清或腸內非透析物等也有抑製作用。其他如硫代蘋果酸、巰基琥珀酸、二異丙基氟代磷酸等均能強烈抑製彈性蛋白酶活力。
（三）加工工藝
提取彈性蛋白酶可以用新鮮胰髒、胰髒丙酮粉及胰蛋白酶等為原料。常用的提取溶劑有pH 4.5，0.1mol/L CH3COONa；含1%～2%鹽的醇性溶劑；也有用磷酸緩衝液，水，0.025mol/L HCl及堿性緩衝液為提取溶劑。提取後可用彈性蛋白、γ-鋁膠、沸石、活性炭或各種離子交換劑進行吸附，再經洗脫、透析，獲得優球蛋白。也可用硫酸銨、乙醇等分級沉澱製備優球蛋白。優球蛋白經重結晶後可以獲得50%～80%純度的彈性蛋白酶。優球蛋白還可用DEAE-C、CM-C、DEAE-Sephadex等精製。近年來還應用離子交換樹脂和親和層析精製彈性蛋白酶。
1.工藝流程
2.工藝要點
（1）丙酮粉製備新鮮或冷凍豬胰髒絞碎，加3倍量0℃以下的丙酮，於0℃左右攪拌脫水1h，離心(廢丙酮回收處理)，濾餅繼續加3倍量丙酮，同法操作，濾餅置真空幹燥箱幹燥、粉碎、低溫密閉保存。
（2）提取丙酮粉加水(質量比為1∶20)於20～25℃。攪拌提取2h，提取液以少量滑石粉助濾，用綿倫布自然過濾或經板框壓濾(20℃以下操作)，得澄清提取液。
（3）樹脂吸附濾液用蒸餾水稀釋至2～3倍，加0.1mol/L、pH 6.4磷酸緩衝液平衡過的AmberliteCG-50樹脂(原料∶樹脂=1∶2)，在20～25℃攪拌吸附2h，收集樹脂，用蒸餾水漂洗樹脂至洗液無色。
（4）解吸樹脂加入pH 9.3、0.5mol/L氯化銨緩衝液(樹脂∶緩衝液=1∶1.5)，攪拌洗脫1h。分離樹脂，洗脫液以2mol/L醋酸調至中性過濾，得澄清解析液。
（5）丙酯沉澱在-5℃下，邊攪拌邊加入3倍量-5℃的丙酮，加完後，繼續攪拌10min，於-5℃靜置，沉澱數小時。
（6）脫水、幹燥收集沉澱，用丙酮、乙醚各洗2～3次，真空幹燥，得彈性蛋白酶原粉。
3.說明與討論
用常法獲得的結晶彈性蛋白酶未經層析法或電泳法純化時是E1與E2的結晶，E1具水解彈性黏蛋白的活力，E2具水解彈性蛋白的活力，電泳行為呈現快、慢兩種成分，是藥用製劑的主成分。電泳均一純或超離心單一峰純的彈性蛋白酶為單一E2成分，純度可達99.9%以上。胰蛋白酶含量＜0.01%，糜蛋白酶＜0.04%，其他酶＜0.001%。另有兩個純化彈性蛋白酶的方法在藥用彈性酶的生產上值得介紹。
（1）誘導結晶法50kg絞碎胰髒加入預冷至4℃的0.1mol/L，pH 4.5的醋酸緩衝液500L，提取4h。濾液加入硫酸銨至0.45飽和度，鹽析物溶於132L 0.1mol/L，pH 7.0磷酸緩衝液中，於20℃活化24h。濾液冷至4℃加硫酸銨至0.35飽和度，收集鹽析物溶於142L 0.1mol/L，pH 7.0碳酸緩衝液中，加入適量彈性蛋白酶晶種，5℃攪拌結晶。
（2）胰髒提取液——離子交換樹脂直接吸附法本法操作方便，收率高，可節省大量丙酮。新鮮胰髒用0.02mol/L、pH 7.3磷酸緩衝液，37℃提取2h，提取液用0.02mol/L，pH4.5醋酸緩衝液平衡過的Diaion Wklos弱酸性陽離子樹脂吸附，繼用1mol/L，pH 7.2醋酸銨緩衝液解吸，經脫鹽、幹燥，每千克新鮮胰髒可獲得1.545g彈性蛋白酶(比活78.1IU/mg)。其他方法如沸石吸附法與親和層析法也有研究。
（四）彈性蛋白酶質量標準與檢驗方法
彈性蛋白酶質量標準執行《Q/NCHR001—2008》，測定酶活力是質量鑒定的主要內容，必須按國家藥典有關內容進行檢測。彈性蛋白酶水解能力的測定方法如下。
1.發酵液預處理
配製200mL的液體發酵基礎培養基，高壓滅菌15min後，向液體發酵基礎培養基中接入枯草芽孢杆菌種。然後，放進振蕩培養箱內。搖瓶發酵結束後，取發酵液，在轉速為800r/min條件離心10min，過濾，收集去菌體的發酵液。
2.硫酸銨分級沉澱
取上述離心過濾的發酵液，在4℃溫度條件下邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨粉末，使飽和度達到30%，4℃靜置過夜。收集沉澱，並取上清液，在上清液中繼續加入硫酸銨粉末至65%飽和度，4℃靜置過夜。再收集沉澱，將兩次收集的沉澱合並，溶於pH 8.0，0.05mol/mL硼酸緩衝液中（彈性蛋白酶的粗提取）。
3.彈性蛋白酶水解能力分析
取新鮮豬皮切成小塊，放入水中煮沸，至水溶液呈黏稠狀，收集溶液。將瓊脂加適量水加熱溶解，然後加入溶液中，攪勻，製成平板。將提取的彈性蛋白酶粗酶取0.1mL加在牛津杯中，在含有15mL肉湯及瓊脂的平板上垂直放好，在條件為37℃的恒溫培養箱內培養24h，來判斷產彈性蛋白酶活力的大小。
（五）藥理作用和臨床應用
彈性蛋白酶具有明顯的β-脂蛋白酶作用，能活化磷酯酶A，降低血清膽固醇，主要是使膽固醇的異化增加，從而增加膽固醇從糞中的排泄量，還能改善血清脂質和增加大動脈的彈性。其主要藥理作用的研究有以下幾方麵：
①能使凝血酶原轉變成凝血酶，使血液凝結；
②對貓產生明顯降壓作用，主要是擴張周圍血管和毛細血管，其降壓作用不受抗組織胺藥物的影響。對大鼠大肢血管有擴張作用，可增加家犬冠脈流量和血中cAMP量；
③能增加蛙的平滑肌緊張，對動情期小鼠能增加子宮收縮；
④能增加肝糖原積累，有抗脂肪肝作用；
⑤能阻止或減輕家兔主動脈冠狀動脈斑塊的形成。
臨床上主要用於治療高脂血症，防止動脈粥樣硬化症，對於Ⅱ型高脂血症療效較好。對於脂肪肝、心絞痛等也有一定預防和治療作用。
五、激肽釋放酶
激肽釋放酶(Kallikrein,EC 3.4.4.21)是一種蛋白酶。哺乳動物的激肽釋放酶有兩大類：血液激肽釋放酶和組織激肽釋放酶。組織激肽釋放酶存在於各種腺體組織及其分泌液或排泄物中，如尿、胰腺及頜下腺等。藥用激肽釋放酶又稱血管舒緩素，國外商品名為保妥丁(Paduin)，主要來自頜下腺或胰腺。目前胰髒激肽釋放酶在國外應用得更為廣泛。
（一）組成和性質
豬胰激肽釋放酶是一種糖蛋白，含有唾液酸，在腺體中以酶原形式存在。由於唾液酸含量的多寡，可以得到1～5個組分，唾液酸的除去並不影響酶的活性。其中常見的有A、B兩種形式，分子質量分別為26800u、28600u，均有二條肽鏈，N-末端為異亮氨酸和丙氨酸，C-末端為絲氨酸和脯氨酸。兩者的氨基酸組成相同，都含229個氨基酸殘基，但兩者含糖量不同，A含糖5.5%，B含糖11.5%。豬胰激肽釋放酶的活性中心為絲氨酸和組氨酸。豬頜下腺激肽釋放酶的分子質量為32000u。
1.專一性
激肽釋放酶是一種內切蛋白水解酶，當它作用於蛋白質底物激肽原後釋放出激素物質激肽。由胰腺等組織激肽釋放酶作用而產生的是胰激肽(10肽)。胰激肽的一級結構是賴—精—脯—脯—甘—苯丙—絲—脯—苯丙—精。激肽釋放酶隻作用於天然激肽原，底物一旦變性後，作用便顯著下降。它對常用的蛋白底物如酪蛋白、血紅蛋白等幾乎不起作用。這是激肽釋酶與一般蛋白酶截然不同的特性。
激肽釋放酶還對小底物表現出酯解活力，如可水解苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE)或甲酯(BAME)，以及甲苯磺酰精氨酸甲酯(TAME)等。胰激肽釋放酶水解BAEE的速率比對TAME高10～30倍。
2.穩定性
一般說，激肽釋放酶的純度越高，穩定性越差。幹燥粉末在-20℃保存數月活力不變。在水溶液中不穩定。但在pH 8.0的水或緩衝液中，可在冷凍狀態下保存相當長時間不失活。在pH 4.5以上，25℃保溫1h，並不失活。但在pH 4.0或低於4.0時，活性的損失卻相當大。根據20～50IU/mg的豬頜下腺激肽釋放酶樣品的試驗結果：在37℃以下，pH 5.0～7.8較為穩定；55℃，5min失活20%；100℃，5min失活80%。激肽釋放酶易為強酸、強堿和氧化劑所破壞，在胰蛋白酶作用下不失活。
3.抑製劑
重金屬離子如Hg2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+等對激肽釋放酶有不同程度的抑製作用。巰基化合物及螯合劑如EDTA等可逆轉金屬離子對酶的抑製。Ca2+和Mg2+對酶活性無影響，相反，高濃度的Ca2+(1mol/L)可使酶活性增加15%～20%。某些胰蛋白酶抑製劑，如抑肽酶、二異丙基氟磷酸等對胰及頜下腺激肽釋放酶有抑製作用。
4.其他性質
豬胰激肽釋放酶在pH 7.0時於282nm處有最大吸收，最小吸收在251nm處。豬頜下腺激肽釋放酶的等電點為pH 3.9～4.37。
（二）豬胰激肽釋放酶的製備
1.工藝流程
2.工藝要點
（1）精品的製備豬胰髒製成丙酮粉(見彈性蛋白酶生產工藝)後，加20倍量0.02mol/L醋酸，於10℃攪拌提取12h，離心。渣加10倍量0.02mol/L醋酸提取6h，合並濾液，加冷丙酮至濃度達33%，過濾，濾液補加冷丙酮至70%，靜置4h，離心，收集沉澱。用丙酮、乙醚脫脂、脫水、真空幹燥，得激肽釋放酶粗品。
（2）中間品的製備粗品激肽釋放酶加50倍量0.2%冷NaCl，用氨水調pH8.0攪拌溶解後經紙漿過濾，濾液應澄清。清液冷至2～3℃，加冷丙酮使濃度達40%，冷室靜置過夜、離心，清液補加冷丙酮至濃度為60%，靜置4h，離心，沉澱用丙酮、乙醚洗滌，真空幹燥，得激肽釋放酶中間品。
（3）精品的製備激肽釋放酶中間品溶於0.001mol/L、pH4.5醋酸緩衝液中，離心。清液加入弱酸性陽樹脂Amberlite CG-50(鈉型)樹脂(樹脂∶中間品=50∶1)攪拌吸附2h，收集樹脂用0.001mol/L、pH4.5醋酸緩衝液漂洗樹脂至無泡沫。樹脂用2倍量1mol/L、pH5.0 NaCl攪拌洗脫1h，分離樹脂，洗脫液透析脫鹽，凍幹，即得精品胰激肽釋放酶。
用離子交換樹脂法精製激肽釋放酶純度可達100IU/mg以上。除用Amberlite CG-50外還有用Amberlite IRX-68、Diaion WA-10、Amberlite IRA-938(強堿性大孔徑陰離子樹脂)等。