此外,還有旋轉過濾反應器(spinfilterbioreactor)、噴射流反應器(gasspargedbioreactor)、渦輪片式反應器(turbinebladereactor)等反應器在毛狀根的大規模培養中也有嚐試性的應用。
五、影響發根培養及次生代謝產物合成的因素
以毛狀根培養生產次生代謝產物,不但要考慮毛狀根的產量,而且還要考慮毛狀根中次生代謝產物的含量。影響毛狀根生長和次生代謝產物合成的主要因素有以下幾點:
1.光
毛狀根培養一般不需要額外的光照,但有些植物的毛狀根光照一段時間後開始變綠,這種綠色毛狀根的生長速度和其中次生代謝產物的含量都大幅度提高,可能是因為一些在原植物其中表達的產物在綠色毛狀根中也得到表達,或是激活了合成途徑中的某種酶,從而促進了次生代謝產物的合成。例如無刺曼陀羅(DaturamermisJacq)毛狀根在光照下變綠,其中莨菪烷生物堿含量大幅度提高;但也有相反的情況,例如高山火絨草(LeontopodiumomumCass)的毛狀根在缺光的條件下培養能增加揮發油的得率。
2.培養基種類及組成
不同基本培養基的種類、碳源、氮源、pH等因素對毛狀根的生長和次生代謝物的含量均有顯著影響,例如江洪如的研究表明Nitch培養基、SH培養基對龍膽(GentianascabraBunge)毛狀根的生長優於MS培養基,而White培養基、HE培養基不利於龍膽生長;Shimomura發現紫草的毛狀根在MS培養基上培養時不能產生任何色素,而在用專門培養根的培養基培養時,卻產生大量的色素並釋放到培養基中;蔡國琴培養青蒿毛狀根時發現,3%的蔗糖有利於毛狀根的生長,但從青蒿素的含量上看,2%的蔗糖濃度為最佳濃度,偏酸性環境(pH<6.0)有利於毛狀根生長和青蒿素的合成,當pH>6.0時,毛狀根生長受到抑製,毛狀根中檢測不到青蒿素。
3.激素
生長素和細胞分裂素常用來調控毛狀根的生長和次生代謝產物的合成,但對不同植物毛狀根的作用不同。例如Arroyo在培養萬壽菊(TagetespatulaL.)毛狀根時加入IAA,毛狀根產生了大量側根,生長速度加快,但噻吩的合成卻受到抑製;張蔭麟發現在含激素的培養基上丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)毛狀根不能正常生長並開始愈傷組織化,但在含激素的培養基上處理2~3d後再移到不含激素的MS培養基上,毛狀根大量分枝,生長速度加快;常振戰發現0.1mg/L的NAA處理能促進掌葉大黃(RheumpahnationL.)毛狀根的生長和側根的產生,但卻抑製毛狀根中遊離蒽醌化合物的合成。
4.誘導子
張蔭麟在培養丹參毛狀根時,以茯苓、風尾菇、紫芝、密環菌4種真菌發酵物作為誘導子分別處理毛狀根,結果發現真菌誘導子能夠促進毛狀根中丹參酮的積累,而且短期內即有明顯效果,其中密環菌發酵物效果最好,處理後毛狀根中丹參酮的含量已接近生藥水平。
另外,在植物體內許多次生物質的合成需要地上部分和地下部分的共同參與,離體培養,有時無論是毛狀根還是冠癭組織均不能合成所需產物,為了解決這一問題,最近有的學者充分利用毛狀根和冠癭組織激素自養性的特點,在同一培養基中共同培養毛狀根和冠癭組織,獲得了較好的結果,例如澳大利亞學者研究發現顛茄(Atropabelladonna)的毛狀根和雜交澳茄(Duboisiahybrid)的冠癭組織共同培養時,產生了高含量的莨菪胺,而在分別單獨培養時均不產生莨菪胺。這一實驗為某些重要次生物質的生產提供了一條新思路。
5.pH值的影響
培養基起始pH值對毛狀根的生長和代謝均有影響,其原因在於pH值對發根生長和代謝中起關鍵作用的酶的活性有影響。如我國的蔡國琴等在培養青蒿發根時觀察到,偏酸性(pH<6.0)有利於發根生長和次生代謝物的合成,70%的青蒿素釋放到培養基中,而當pH大於6.0時,生長受到抑製,隻能在培養基中檢測到少量青蒿素,而在發根中則檢測不到。
6.培養方法
例如固體培養、液體培養法進行成批培養或大規模發酵培養、兩步培養法、兩相培養法、反複成批培養、補料成批培養等。
7.生物反應器
發根易受到剪切力傷害,且其生長迅速,密度高,供養困難,保持低的流體壓力和高的溶氧量十分必要;通氣性能良好且剪切力較小的反應器是其理想反應器。目前發根生物反應器結構及其培養係統的研究主要集中在兩個方麵:一是盡可能降低機械剪切力對發根的損失(減少攪拌);二是提高氣液傳質速率,增加溶氧量。
此外,毛狀根的生長和次生代謝物合成還受到激素濃度、氧氣、磁場強度及無機鹽濃度的影響。在實際培養中,要根據不同藥用植物的特性,綜合考慮各個因素,從而得到一個最佳的培養條件。
六、發根培養中存在的問題及措施
雖然在獲得次生代謝物質方麵發根培養與其它方式相比具有一些不可比擬的優勢,但是在其自身發展過程中也存在著一定的問題,主要表現在:
(一)有些植物發根難誘導,各轉化係統相對獨立,無模式係統。這就要求我們大量篩選菌種,采用合適的外植體,綜合利用各種理化因子。
(二)有些發根生長不太快,有些難以維持正常的形態,常出現脫分化形成愈傷組織或分化出幼苗、胚狀體等現象,致使生產能力下降、培養失敗。解決的辦法是采用合適的培養方法,必要時調節營養及激素水平,使發根維持正常的形態及快速生長和次生物質的生產能力。
(三)限製發根培養應用的一個原因是其大規模培養問題。
總之,發根培養是一種新興的、非常有前途的培養技術。能夠合理、有效的解決其發展過程中出現的一係列問題必將為植物次生代謝物質的生產做出巨大的貢獻。
七、毛狀根誘導實例
以人參毛狀根的誘導為例。
(一)人參毛狀根的誘導及鑒定
劉峻等利用發根農杆菌ATCC15834感染人參(Panaxginseng),首次從人參帶葉幼莖處誘導出毛狀根,用激素和As(乙酰丁香酮)處理可提高轉化率並縮短轉化時間。毛狀根在無激素B5,培養基上生長並失去向地性,月增長倍數可達50倍(鮮重)。
利用T-DNA中的rolC基因特異引物進行PCR擴增,陽性對照為含有T-DNA的農杆菌R15834和已鑒定的轉化西洋參,陰性對照為人參原植物及誘導的愈傷組織。PCR結果表明從農杆菌R15834、西洋參毛狀根和R15834轉化的人參毛狀根中均擴增到了長度為564bp的rolC基因片段,而未轉化人參組織基因組DNA中擴增不到該片段,從而在分子水平上證實了人參毛狀根基因組中已整合了外源Ri質粒中含有rolC序列(564bP)的T-DNA片段。采用已鑒定的西洋參毛狀根作為陽性對照,未轉化的人參細胞為陰性對照,用薄層層析(TLC)來檢測冠癭堿。結果發現,西洋參毛狀根和人參毛狀根顯色結果呈陽性,在相同位置出現棕色斑點,而未轉化的人參細胞無斑點出現,證明Ri質粒的T-DNA已整合到轉化的細胞中,並表達合成特異的冠癭堿。
(二)人參毛狀根中人參皂苷的積累條件的優化
提取人參原藥材、人參細胞和人參毛狀根中的總皂苷,以人參二醇(中國藥品生物製品檢定所)為標準晶,利用比色法進行含量測定,結果表明人參毛狀根中皂苷含量2.486%(幹重)高於原藥材1.403%(幹重)。該研究還表明生長素在適宜的濃度下可不同程度地促進人參毛狀根的生長以及皂苷的積累,同時能影響單體皂苷的分布。NAA和IBA能顯著促進毛狀根的生長,其中0.5mg/L的IBA能顯著促進毛狀根生長和總皂苷的積累。細胞分裂素6-BA在較低濃度時雖然對生長無明顯的促進作用,但對皂苷積累有利,同時顯著促進單體皂苷Rbl的積累,增大Rbl在總苷中所占的比例。
該課題組還研究了水楊酸(SA)、酵母提取物(YE)和AgNO3,等誘導子對人參(ParnaxginsengC.A.Mey.)毛狀根皂苷含量的影響。結果表明SA能明顯促進Rbl、Re、Rgl和Rd等4種單體皂苷的積累,而且能促進人參皂苷分泌到細胞外並在培養液中積累。YE和10mmol/LAgNO3不但能促進人參毛狀根中總皂苷含量和單體皂苷的積累,還能促進人參皂苷的分泌。
(三)人參毛狀根生物合成熊果苷
熊果苷是抑製酪氨酸酶活性的優良天然產物,將人參細胞與熊果苷配伍在化妝品中具有廣泛的應用。天然熊果苷來自熊果、越橘等植物,未曾見存在於人參屬植物中的報道。劉峻等還利用高效液相色譜法(HPLC)測定了熊果苷標準品溶液、未加前體(氫醌)的人參毛狀根樣品溶液(蒸餾水超聲浸提)、加前體的人參毛狀根樣品溶液,從譜圖的相互對比發現標準品的峰在標準品溶液、加前體的樣品溶液的圖譜中以相同保留時間出現,而未加前體樣品溶液的圖譜中無此峰,從而確定熊果苷隻存在於加人前體的人參毛狀根中,證明了人參毛狀根能將氫醌合成為熊果苷,其機製可能是在毛狀根中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)糖基轉移酶作用下,其富含的葡萄糖高能活化形式--UDPG與氫醌生物合成為熊果苷。該研究的結果表明人參毛狀根合成熊果苷的能力受多種因素影響,在毛狀根培養22d、氫醌的濃度為2mmol/L、轉化持續24h的條件下熊果苷的含量最高(占毛狀根幹重的13%),轉化率最高(89%)。
該研究首次利用人參毛狀根將氫醌糖基化。氫醌是酪氨酸酶活性抑製劑,但刺激性強,副作用大,僅在臨床中限量使用;被轉化為天然的熊果苷後,水溶性增強,毒性降低,擴大了使用範圍,人參毛狀根合成熊果苷不僅對研究葡萄糖苷生物合成有所啟發,而且極具有開發利用價值。