四、毛狀根的大規模培養
我國是世界上使用和出口藥用植物最多的國家，而中藥材的80％以上來自藥用植物，隨著中藥現代化研究的深入和中藥產業規模的擴大，對藥用植物資源的用量會不斷增加。除野生采集外，藥用植物的大田栽培是目前提供中藥材的主要途徑。但我國是世界上人均可耕地麵積最少的國家之一，有限的可耕地資源用於種糧食尚且不足，還要用大量的土地種植藥用植物，這必然會產生中藥材栽培與農作物栽培爭地的矛盾。因此利用生物反應器技術進行藥用植物工業化水平的發酵培養，對我國有著特殊的意義。
(一)生物反應器應用於植物組織、細胞培養的發展概況
1959年，微生物培養用的發酵工藝被首次用於高等植物細胞的懸浮培養，揭開了用生物反應器培養植物細胞的序幕，此後應用範圍便逐步擴大，目前生物反應器用於植物懸浮細胞培養、植物細胞固定化培養、植物器官（包括毛狀根、芽、體細胞胚和冠癭組織）培養均有報道。
由於植物組織和細胞培養相比微生物培養的複雜性（如對營養要求複雜、對剪切力敏感、細胞容易聚集、接種密度大、倍增時間長、代謝速度慢等），傳統的微生物反應器對植物細胞和組織培養並不適合，許多有別於傳統微生物反應器的植物細胞培養反應器被研製出來並不斷得到完善。1980年，Ibaraki成功進行了人參（Panaxginseng）細胞的工業化發酵培養，1985年Tabata工業化培養紫草（Lithospermumerythrorhizon）細胞生產紫草素（shikoilln）獲得成功。此後有關植物細胞大規模培養的相關研究逐步走向深入，如藥用植物細胞在搖瓶和反應器中生長規律的探討、細胞在反應器中的生長動力學考察、最佳供氣條件及滲透壓的影響、前體物質的飼喂和生物轉化、誘導物（elicitor）的使用、針對不同個體材料的反應器的研製及對藥用植物次生代謝機製的研究（主要集中在人參皂苷、紫杉醇、長春新堿等代謝機製的研究）。
藥用植物細胞培養有一個非常大的弊端，即有效成分的含量比較低且不穩定，而器官培養可以克服這一缺點，因此近幾年藥用植物器官（主要是毛狀根）的大規模培養已逐漸成為該領域的研究熱點。韓國已經在高麗參毛狀根的發酵培養方麵取得了突破性進展，如高麗參的器官培養成功地進行了工業化，反應器的規模已經達到1000L，10000L的反應器也在研究之中。同時，還以培養的高麗參毛狀根開發了係列保健品和化妝品。德國科學家利用培養印度獐牙菜（SwetiachirataHamihon）的毛狀根成功生產苦杏苷（amarogentln），研究表明用Tween20對培養的毛狀根進行滲透性處理可使苦杏苷的含量增加15倍。
(二)適用於毛狀根大規模培養的生物反應器
由於植物毛狀根培養具有生長迅速、分枝多、不需要外源生長激素等特點，因此用於毛狀根的生物反應器的選擇和設計也應適應這些特點，而和植物細胞反應器有所區別。英國、日本、韓國及中國等國的科學家已對毛狀根生物反應器進行了一些基本研究，並對紫草、甜菜、胡蘿卜、長春花等多種毛狀根進行了大規模生產研究。研究發現，在培養後期，毛狀根數量增加並且形成團狀結構，使中間部分接觸不到營養物質和氧氣，導致該部分毛狀根老化，同時使攪拌效率降低，有的在培養液中基本處於靜止狀態。和細胞懸浮培養相比，其混合物質傳遞和培養環境的控製比較困難。因此在毛狀根大規模培養中，如何使培養液充分混合和均一供氧是關鍵因素，為此要選擇合適的反應器類型，盡量降低剪切力對毛狀根的損傷。
1.攪拌式反應器
攪拌式反應器（stirredtankreactor）是傳統的反應器類型，在微生物發酵培養中應用很廣，從牛頓型流體到非牛頓型的絲狀菌發酵液都可以應用。這種反應器有葉輪，混合性能好，傳氧效率高，操作簡單，反應體係均勻，它的溶氧量易通過轉速和通氣量控製。但這種反應器耗能大，並且由於輪片旋轉產生的剪切力易使植物細胞，尤其是毛狀根造成傷害，使之愈傷組織化，從而不利於大規模培養。應用攪拌式反應器時，還發現植物細胞易在攪拌器和底部通氣裝置之間堆積，由於營養物質缺乏而導致褐化死亡。為了將之應用於植物細胞和毛狀根培養，有研究工作者對這種反應器進行了改進，采用較大的平葉攪拌器或槳形攪拌器，並以相對低的速度攪拌，提供良好的攪拌效果，即使在高生物量時培養液也能得到較充分的混合，並能有效減少由於攪拌對植物細胞和毛狀根造成的傷害，但這種改進型仍然存在著體係放大的困難。JungG等采用這種反應器進行了顛茄（Atropabelladonna）和旋花籬天劍（Calystegiasepium）毛狀根的大規模培養生產多巴生物堿，容積達到1.0L。經過改進的反應器能很好地適合植物細胞和毛狀根的生長，所以對攪拌式反應器的研究有很大的潛力。Hilton等利用一個改進的14L攪拌式反應器進行曼陀羅（DaturastramomumL.）毛狀根培養生產天仙子胺，並通過一個不鏽鋼網將攪拌區和毛狀根生長區分開，獲得了較好的結果。
2.鼓泡式反應器
鼓泡式反應器（bubblecolumnreactor）是結構最為簡單的反應器，氣體從底部通過噴嘴或孔盤穿過液池實現氣體傳遞和物質交換。它不含轉動部分，整個係統密閉，易於無菌操作，培養過程中無需機械能消耗，體係放大容易。由於產生較少的剪切力，所以適合對剪切力敏感的細胞和毛狀根的培養。但該反應器對氧的利用率低，對高密度及黏度較大的培養體係，反應器的混合效率會降低，並且經常會出現非循環區。在這種反應器中，要注意泡沫產生速率需要隨著毛狀根的增長而應逐步增加。這種反應器已被用於顛茄（AtropabelladonnaL.）、長春花[Catharanthusroseus(L.)G.Don]、孔雀草（TagetespatulaL.）等多種植物的毛狀根的大規模培養。如Sharp等利用2.5L的鼓泡式反應器培養顛茄毛狀根生產莨菪生物堿，經20d培養，生物量幹重達到5.6g/L，但在培養過程中發現混合效率差，部分毛狀根沉積在底部。
3.氣升式反應器
氣升式反應器（airliftbioreactors）沒有葉輪，結構簡單，借在中央拉力管中用壓力空氣射流，誘導液體自拉力管內上升，然後自拉力管外的環隙下降，形成環流，因而比鼓泡型反應器有更均一的流動形式。氣升式反應器攪拌速度和混合程度由通氣速率、氣體噴射器的位置和構型（如噴嘴和燒結口）、容器的高度與直徑比、升降速率比、培養液的黏度和流變性等因素決定。低氣速、高密度培養物條件下，該反應器同鼓泡式反應一樣，容易出現非循環區，混合效果差。通氣量提高會導致氣泡產生，影響細胞和毛狀根生長，可通過加消泡劑來解決。Rodriguez-Mendiola等用帶有不鏽鋼網導流筒的9L氣升式生物反應器大規模培養胡盧巴（Trigonellafoenum-graecum）的毛狀根生產薯蕷皂苷元，在此反應器中毛狀根生長分布較為均勻，在生長過程中，毛狀根逐漸掛到不鏽鋼導流筒上，然後向四周平衡生長。這種改進的反應器接種方便，易於放大。
4.轉鼓反應器
轉鼓反應器（rotatingdrumbioreactor）主要由安裝在轉頭上的一個鼓形容器組成。因為轉子的轉動促進了液體中溶解的氣體與營養物質的混合，因此具有懸浮係統均一、低剪切環境、防止細胞粘附在壁上的優點，適於高密度植物懸浮細胞的培養。這個鼓形容器通常旋轉較慢，以減少剪切力對毛狀根造成的傷害。例如Kondo等利用轉鼓冒反應器大規模培養胡蘿卜毛狀根，並在轉鼓內表麵固定了一層聚氨酯泡沫（polyurethanefoam），毛狀根附著其上並且生長良好。該反應器也存在著體係放大的困難。
5.超聲霧化反應器
營養液超聲霧化技術應用於植物組織培養最早由Weathers等首先提出，此後，營養液超聲霧化反應器（ultrasonicmistbioreactor）應用於組織培養的研究日益增多，涉及微生物和動、植物組織及器官培養等領域，具有結構簡單、操作方便、成本低等特點。由於采用霧化方式供氧，使營養液在反應器中能迅速擴散，分布均勻，反應器中供氧充足，濕度可調，其應用於毛狀根大規模培養時，不僅避免了攪拌和通氣培養帶來的剪切力損傷，而且可解決植物器官長期液體浸沒培養所帶來的玻璃化和畸形化現象。目前的超聲霧化反應器主要有兩種形式：一種是霧化裝置與培養裝置分開，利用氣體將營養霧由霧化裝置帶入培養裝置，該裝置結構較複雜，並且營養霧的濃度較低；另一種是霧化設備與培養裝置為一體，結構較為簡單，顯示了良好的商業應用前景。劉春朝對霧化設備與培養裝置結為一體的霧化反應器中營養液在超聲霧化過程中理化因素的變化及反應器結構對營養霧流動的影響進行了探索，結果表明超聲振動產生的能量使培養液成為細小的液滴，營養霧的成分與原液體培養基相同。霧化過程中反應器底部的培養液和營養霧的溫度隨霧化時間的延長逐漸升高，這是由於超聲振動產生的能量有一小部分轉化為熱能所致。所以在使用該反應器時，應根據培養物對溫度的敏感性選擇合適的霧化時間。為減少營養霧溫度的上升，利用超聲進行霧化培養時，一般采用間歇霧化方式，霧化時間以5min左右較為合適。劉春朝還自製了改進的內環流超聲霧化反應器，在霧化反應器霧化頭正上方距離營養液2～3cm的位置設置中心導流筒（長20cm，內徑2.5cm），同時在篩網間中心導流筒上開設圓孔，在霧化時營養霧從導流筒的頂端和導流筒壁上的圓孔同時冒出，使營養霧基本上能夠充滿整個反應器培養空間，而且無需氣體輸送。在利用霧化反應器進行植物組織多層培養時，在篩網間的導流筒上開孔，使營養霧能夠更快地充滿整個反應器，尤其在培養後期頂層的培養物長得致密時，從頂端冒出的營養霧在沉降過程中多被上層所吸收，此時中間各層間的開孔可以較好地將營養霧送至中間各層，使培養物獲得充足的養分。在反應器中還增加了篩網分層，避免了生長後期毛狀根的沉積和結團。劉春朝利用這種改進的內環流霧化反應器進行青蒿毛狀根的培養，毛狀根在反應器中生長健壯，形態正常。