正文 第三節人工種子(2 / 3)

海藻酸鈉作為人工胚乳,具有無毒、資源豐富、價廉及工藝簡單等特點被廣泛應用於人工胚乳的製作。不足的是存在著營養物質易滲漏、透性差而阻礙體細胞胚的生長、膠粒易失水變幹及失水後的吸水回脹率低、膠粒本身帶有黏性和不便於貯存、運輸和播種等問題。選用無毒、透氣和吸水性強的木薯澱粉與1.5%海藻酸鈉(1/2MS培養基配製)混合製作的胚乳可改善單一海藻酸鈉人工胚乳的透氣性、吸水性和發芽率(黃紹興,等.1995年),人工胚乳中加入GA3有利於人工種子的發芽,加人CaCl2有利於向培養物供氧,提高人工種子發芽率和耐貯藏性,加藥用炭可改善營養固定和緩釋(陸承勳,1990年),提高人工種子在土壤中的成苗率(楊光孝,1995年)。因而,用激素(GA3等)、緩釋物(藥用炭等)、固化劑(CaCl2等)、抗生素及其他混合物(木薯澱粉等)製作全能性人工胚乳將是今後發展的目標。此外,人工胚乳中除供體細胞胚生長和發育所需要的水分、養分以及植物激素外,還可以根據使用者的需要,有選擇地向人工胚乳中加入各種不同的物質,如添加農藥、菌肥、除草劑、激素等物質,以增加和提高人工種子抵抗病蟲害的能力等。

(四)人工種皮製作

人工種皮是指人工胚乳外麵包裹的一層保護膜,它類似於天然種皮,既能保持種子內的水分和營養免於喪失,又能保證通氣及防止外來機械壓力引起的損傷。人工種皮的製作通常包括兩個部分:內膜和外膜。作為人工胚乳支持物的內膜應具備的條件為:

1.對繁殖體無毒、無害,有生物相容性,能支持胚。

2.具有一定透氣性、保水性,不影響人工種子貯藏保存,而又使人工種子在發芽過程中正常生長。

3.具有一定強度,能維持膠囊的完整性,以便人工種子的貯藏、運輸和播種。

4.能保持營養成分和其他助劑不滲漏。

5.能被某些微生物降解(即選擇性生物降解),降解產物對植物和環境無害。複塗外膜除了能有效提高人工種子的保水能力和防止營養滲漏,還可保護人工種子不受土壤中的微生物、溫度和pH變化,以及其他生物和物理化學因素的影響;同時便於人工種子的運輸、貯藏和播種。目前,已經建立了若幹種在人工乳膠囊上包裹外皮的工藝。

(五)人工種子的包埋

1.人工種子的包埋方法主要有:液膠包埋法;幹燥包埋法;水凝膠法。

(1)液膠包埋法是將胚狀體或小植株懸浮在一種黏滯流體膠中直接播入土壤的方法。Drew(1979年)用此法將大量的胡蘿卜體細胞胚放在無糖而有營養的基質上,獲得了3顆小植株;接著Baker(1985年)在流體膠中加入蔗糖,結果有4%的胚活了7d。

(2)幹燥包埋法是將體細胞胚經幹燥後再用聚氧乙烯等聚合物進行包埋的方法。盡管Kitto等人報道的幹燥包埋法成株率較低,但它證明了體細胞胚幹燥包埋的有效性(陳德富,等.1995年)。

(3)水凝膠法是指用通過離子交換或溫度突變形成的凝膠包裹材料進行包埋的方法。Redenbaugh等(1987年)首先用此法包裹單個苜蓿體細胞製得人工種子,離體成株率達86%,以後這種包埋法很快被其他人工種子研究組廣泛采納。

2.以海藻酸鈉作包埋劑的操作程序

(1)先把胚狀體和2%~4%的褐藻酸鈉及營養成分混合在一起,再滴入2.5%的氯化鈣中,經20~30min後便形成膠囊丸似的園形人工種子,放在無菌水漂洗20min。

(2)人工種皮裝配早期使用Elvax4260塗膜,價格昂貴,操作複雜、包裹效果不盡人意。新近試驗使用的二氧化矽化合物材料包括疏水的Tullanox和微親水的Cab-O-Sil,二者均可以粉末狀包裹在人工種子膠囊外層,操作時隻需將膠囊在上述材料中滾動即可完成包被過程,操作簡單易行,大量生產還可以機械化操作。還有一種矽酮種衣,它不僅可以抗真菌,而且可滲入水蒸氣和氧氣,這些材料均還處於試驗之中。

(3)若硬度合適,立刻把人工種子放在水中洗,使其停止交換。這種膠囊丸通常較濕,可能互相粘連,可在表麵加一層疏水締界麵,降低粘性。

(六)人工種子的貯藏和萌發

目前人工種子多數放在4℃低溫條件下保存。但隨保存期延長而使萌發率下降。美國把人工種子放在液體石蠟之中,保存時間可達6個月以上。用胡蘿卜做材料,將人工種子幹燥脫水儲藏,在溫度7℃條件下,兩個月後發芽率接近100%。

三、人工種子實用化的關鍵技術

(一)體細胞胚的質量及大規模生產

體細胞胚是人工種子的主體,其質量直接關係到人工種子的萌發率,即要得到正常植株,必須獲得高質量的胚,體細胞胚的質量應達到形態學上基本無變異、胚發生比較同步或比較整齊並能得到較高頻率的正常植株的要求。經過愈傷組織階段後,胚狀體有可能產生無性係變異,這些變異或是外植體本身存在,或是在培養過程中產生的,若用來製作人工種子,則可能產生植株的變異。這種變異限製了人工種子的應用範圍。人工種子經幹燥、低溫和脫落酸(abscisicacid,ABA)等處理後,畸形子葉的數會增加;采用懸浮法產胚可提高正常雙子葉苗比例,而添加肌醇、葡萄糖的MS液體培養基比含激動素KT的MS液體培養基上的體細胞胚形態發育更正常。激素能起到改善胚形態的作用,許多報道都認為ABA能提高胚的抗逆能力和貯藏物質的含量,增加胚幹重,促進體細胞胚以正常形態發育,但對於不同的植物,ABA發揮作用的時期有所不同。有研究表明在改進了胚發生過程後,冷處理能促使胚的成熟。為了提高體細胞胚的整齊度,首先從細胞角度的同步化處理考慮,可以通過采用DNA合成的選擇抑製劑或低溫處理,來達到同步脫分化促進細胞的同步分裂;不同發育階段的胚狀體對滲透壓有不同的要求,因此也可以調節滲透壓來控製胚的發育,使其停留於某一階段。其次,可以用過濾、離心、密度梯度離心、玻璃珠過濾和機械分級分選等方法,對不同發育階段的體細胞胚進行篩選。最後,為了獲得大量均一的體細胞胚,可以利用生物反應器和分選儀法配套的技術,即采用生物反應器大量生長體細胞胚,繼而分選儀法分選體細胞胚和用體細胞胚製作人工種子。分選儀法可將合適的胚分選出來供製種應用,較小的胚及細胞團仍保持在無菌狀態而有可能送回生物反應器繼續發酵生產體細胞胚。目前反應器雖能產生大量的胚(苜蓿1600~6600個愈傷組織),但苗轉化率隻有2%-3%,遠低於常規培養。若用化學因素處理胚,雖對提高同步發生有一定效果,但畸形胚卻明顯增多。一般認為重複過濾法較簡便且可避免化學物質處理等所誘導的體細胞變異。

(二)人工種皮內膜包裹材料的選擇

根據內膜篩選的原則,前人的研究結果表明,海藻酸鈉、明膠、果膠酸鈉、洋槐豆樹膠以及Gel-riteTM均可作包埋基質。其中以海藻酸鈉用得最廣,這主要是因為海藻酸鈉具有生物活性,無毒,成本低,包埋製作工藝簡單等其他物質不可替代的優點。但是,海藻酸鈉也存在一些缺點,如保水性差,水溶性營養成分及助劑易滲漏,易失水幹燥且不能吸水回脹;膠球容易粘連,機械強度差,不便於機械化播種;含水量過高等,致使人工種子的研究曾一度徘徊於實驗室階段,不能推廣實用化。為克服海藻酸鈉的不足,人們在兩方麵進行了嚐試:一是在海藻酸鈉中添加一些物質,入加藥用炭可減少營養物質的滲漏,加滑石粉能解決膠球粘連並有利於機械播種;二是尋找新的包埋基質和新的包埋工藝來完善人工種子製作技術。

(三)人工種子的防腐

研究人工種子的最終目的是為了田間應用,由於人工胚乳中含有糖類等有機物質,加之目前尚未得到真正稱為人工種皮的包裹材料,富含營養的人工胚乳一旦暴露於田間這種開放係統,除了失水幹燥外,勢必會遭微生物的浸染。因此必須采取一定措施使人工種子具備相當的防腐抗菌能力。在人工種子中添加有效成分,加速其萌發,這樣能避免爛種及人工胚乳中養分的過度流失,有報道說在胡蘿卜人工種子中添加赤黴素能達到此效果。而在包埋介質中添加到防腐劑隻要保證人工種子發芽前不染菌即可,但要找到對胚無傷害,尤其是不影響胚的正常發育和萌發的防腐劑,還很困難。當人工種子進入大規模田間種植階段,主要操作者為農民,為了方便操作及降低成本,建議所用的防腐劑從農藥中篩選。另外一條更為理想的途徑是篩選到與天然種皮有相似特性的高分子材料作人工種皮。

(四)人工種子的貯藏由於農業生產有季節性,人工種子的貯藏也成了必須解決的問題。目前報道的方法有低溫法、幹燥法、液狀石蠟法、抑製劑法等。貯藏人工種子要做到讓人工種子在貯藏期間不發芽,避免在以後的播種中易受傷,避免生長不整齊或根係風幹致死。液狀石蠟不能抑製發芽,而低溫能有效地抑製發芽,減慢生長速度。有報道指出液狀石蠟法或幹燥法與2℃低溫結合使用能提高人工種子的貯藏效果。幹燥失水能使體細胞胚停滯生長並保持其在貯藏中的活力,但對人工種子的傷害較大,以致複水後幼苗生長勢差。低溫、幹燥、ABA處理及減少培養基中的糖分等方法常用於人工種子和植物體細胞胚的貯藏。目前廣告語人工種子發育的實驗大部分都限於無菌條件下,因此國內外已發表的所有關於植物體細胞胚及其人工種子貯藏實驗多在無菌條件下進行,這些結果可供將來有菌條件下的貯藏參考。