1978年在加拿大召開的第四屆國際植物組織培養會議上,著名的植物組培專家Murashige首次提出利用植物組織培養中具有體細胞胚胎發生的這一特點,把胚狀體包埋在膠囊內形成球狀“人工種子”。大量繁殖體細胞胚並製成人工種子為無性繁殖開辟了嶄新的領域。建立並發展人工種子技術可以快速繁殖一個優良品種,以保持它們的優良種性和整齊度。由於人工種子在本質上屬於無性繁殖,所以它與天然種子相比,具有可工廠化大規模製備、貯藏和迅速推廣優良種質資源等優點,因而受到許多國家重視。歐洲將植物人工種子列入尤裏卡計劃,我國也於1987年將其列入國家高技術研究與發展計劃(李修慶,1990年)。經過近20年的研究,植物人工種子研究取得了很大進展,並成功地用於大田和溫室的生產(葉克難,等.1993年)。一些藥用植物名貴品種,難以保存的種質資源、遺傳性能不穩定或育性不佳的材料,均可采用人工種子技術進行繁殖。
一、人工種子的概念、結構和特點
(一)人工種子的概念
植物人工種子(plantartificialseeds),也叫人造種子(syntheticseeds),是指將植物離體培養中產生的體細胞胚或能發育成完整植株的分生組織(芽、愈傷組織、胚狀體等)包埋在含有營養物質和具有保護功能的外殼內形成的在適宜條件下能夠發芽出苗的顆粒體(陳德富,等.1995年)。簡而言之,就是由植物體細胞胚(somaticembryos)或類似物被營養性膠及保護膜所包埋而形成的類似於天然植物種子的結構。人工種子在適宜的條件下亦能萌發或轉化成完整的植株。
狹義的人工種子也叫人造種子,是指通過組織培養技術,將植物的體細胞誘導成在形態上和生理上均與合子胚相似的體細胞胚,然後將它包埋於有一定營養成分和保護功能的介質中,組成便於播種的類似種子的單位。人工種子的外層被有機的薄膜包裹(人工種皮),防止水分丟失和外部的物理力量衝擊,中間含有胚狀體萌發時所需的營養成分和某些植物激素(人工胚乳),裏麵是被包埋的胚狀體或芽。這樣,用人工的方法可創造一種與天然種子相類似的結構。
廣義的人工種子包括未經包裹的直接播種的體細胞胚;用多個體細胞胚被包裹成餅狀;體細胞混在凝膠中,用流質播種;凝膠包裹的頂芽、腋芽、小鱗莖等也屬於人工種子。
(二)人工種子的結構
完整的人工種子包括3大基本部分:體胚(somaticembryo)、人工胚乳(artificialendosperm)、人工種皮(outorsecondseedcoat)。它具備類似天然種子的基本結構和功能。
1.體胚
體胚,即胚狀體(分生組織),它相當於天然種子的胚,是有生命的物質結構;主要是由組織培養中獲得的體細胞即胚狀體、愈傷組織、原球莖、不定芽、頂芽、腋芽、小鱗莖等繁殖體組成。
2.人工胚乳
人工胚乳是供胚狀體維持生命力和保證其在適宜的環境條件下生長發育的,一般由含有供應胚狀體養分的膠囊組成,養分包括礦質元素、維生素、碳源以及激素等。
3.人工種皮
人工種皮具有保護作用,它應像天然種皮一樣能在適宜條件下維持胚狀體正常的生長發育,這就要求它必須具備透水透氣、固定成型、耐機械衝擊且不損壞的特性。
Redenbaugh等(1987年)將人工種子生產的候選植物分為兩大類:一類是技術基礎強的植物,這類植物已有建立好的體細胞胚發生係統;另一類是商業基礎強的植物。早期的植物人工種子研究一般僅限於前者,如胡蘿L、苜蓿和芹菜等模式植物(Murashige,1978年;Redenbaugh,等.1987年;湯紹虎和孫敏,1994年),都是利用包埋體細胞胚來製作人工種子,但實際上這些模式植物幾乎沒有必要用人工種子作為繁殖手段。真正有意義的是那些有較高經濟價值的作物,Kamada(1985年)指出,若從經濟角度出發,多年生或無性繁殖植物首先具有人工種子應用的潛力。但是,這類植物一般難以得到高質量胚狀體,加之其體細胞胚存在無性係變異、幼苗期較長以及苗轉化率較低等缺點,使人工種子技術在一些重要經濟植物和珍稀瀕危植物中的應用受到限製。
(三)人工種子的特點
1.人工種子具有數量多、繁殖快的特點
通過組織培養產生的胚狀體,1L培養基中可產生10萬個胚狀體。提供營養的“種皮”可按不同植物對營養的需求來配製,更有利於胚狀體的生長發育和進行機械化播種,使其苗全、苗壯。特別在人工造林方麵,人工種子比現時采用的試管苗繁殖更能降低成本和節省勞力。
2.可以保留雜種優勢
由於體細胞胚沒有經過有性過程,從無性繁殖體係產生,可以保留雜種優勢。隻要有優勢強調組合,通過人工種子可以多年使用,免去了複雜的雜種配製過程。不因減數分裂引起重組分離。
3.可以在製作時加入對植物生長發育有利的物質
人工種子中,可以在製作時加入對植物生長發育有利的物質比如針對植物的某些病害加入農藥;為促進生長可加入某些菌肥或有益微生物,也可以加入植物生長調節物質。
4.植物胚狀體的發育途徑,為高等植物細胞工程和基因工程的整體表達提供了重要的前提條件。
另外人工種子還便於運輸和保存。
二、人工種子製作的基本環節
人工種子的製作主要包括胚狀體的誘導、包裹製種和發芽試驗。用體細胞胚包埋製作人工種子的係統是由Redenbaugh等人建立起來的,其製作流程如下:選取目標植物;從合適外植體誘導愈傷組織;體細胞胚的誘導(最好在發酵罐中進行);體細胞胚的同步化;體細胞胚的分選;體細胞胚的包裹(人工胚乳);包裹外膜;貯藏;發芽成苗實驗;體細胞變異程度與農藝研究。
(一)體細胞胚的誘導和形成
在植物體細胞胚的誘導過程中,影響誘導體細胞脫分化、再分化和發育過程的因素很多。大量研究表明,選擇適當的外植體、激素調節以及培養基中的營養成分起著決定性的作用。
1.外植體的選取
外植體的來源及其所處的發育階段(生理狀態)是影響體胚發生的重要因子。一般來說,子葉、胚株、葉片、胚及幼胚和下胚軸、幼花序軸都是較合適的外植體。對於單子葉植物特別是禾本科植物,那些細胞分裂旺盛的分生組織和器官,如葉原基部、莖尖、幼胚、胚珠、花序軸等生殖器官都是極好的外植體。當用幼胚作外植體,胚接種時位置取向極為重要,胚芽及胚根、胚軸必需接觸培養基而使盾片向上,使其增殖而誘導出胚性愈傷組織。誘導體胚能力還和作物品種有關。例如,秈稻在已試驗的50多個品種中,龍晴2號和湖秈兩個品種的體胚誘導率高於其他品種,而其餘40多個品種分化體胚的能力較差。
2.激素調控在產生體胚中的作用
許多研究表明,對於體胚發生誘導作用的2,4-D應用是較為廣泛的,它的濃度因植物品種及其基因型不同而有差異。通常濃度為2mg/L。許多研究表明,對於體胚發生誘導作用的2,4-D應用是較為廣泛的,57.5%的雙子葉和所有單子葉在胚性細胞形成中運用2,4-D,它的濃度因植物品種及其基因型不同而有差異,有效濃度0.2~5mg/L,單子葉植物要求濃度較雙子葉植物高。人們發現體胚的形成分為兩個階段。第1階段為誘導階段,培養基中必須加入2,4-D。第2階段為體胚形成階段,2,4-D的濃度要降低甚至除去,以利體胚的正常發育。激動素KT濃度在0.5~1.5mg/L範圍內被認為在誘導正常的胚性細胞的產生是很重要的。有實驗證明,單用2,4-D在水稻中僅誘導出非胚性細胞,而用2,4-D1mg/L加KT0.5mg/L卻能誘導出胚性細胞。
3.氮素和氨基酸對胚形成的影響
還原態的氮,如硝酸銨、氯化銨等,在誘導體細胞胚的發生中很有效,而硝態氮效果不太明顯,除NH4+的形式外,椰子汁、酪蛋白的水解物以及氨基酸均可作為還原氮源。
4.光照和其他培養條件
體胚發生對光暗周期的要求因植物種類而異,例如煙草和可可體胚發生要求高強度光照,而胡蘿卜和咖啡的體胚發生則在全黑的條件下較合適。此外,每瓶接種外植體數目、外植體轉移次數和培育物繼代的頻率等都會影響體胚發生的頻率,細胞間存在信息交流和相互作用。因此懸浮培養是要求一個最小有效密度。在誘導體胚大量發生後,還要注意高質量胚的選擇。體胚的形態發生過程與合子胚相似,經過原胚、心形胚、魚雷胚、線形胚和子葉胚等階段。作為人工種子包裹的材料,魚雷胚、線形胚和子葉胚是較好的材料。
(二)體細胞胚胎發生的同步控製
人工種子的研製必須使胚狀體同步發生。但控製胚狀體的同步生長,卻仍存在不少問題。近年來,對這個問題進行了許多研究,取得了較大進展。實踐表明,在細胞培養的初期加入5-氨基尿嘧啶等DNA合成抑製劑,使其暫時停止DNA合成。在除去抑製劑後,細胞開始進入同步分裂。采用低溫處理抑製細胞分裂,再把溫度提高到正常培養溫度,也能達到部分同步化的目的。
用尼龍篩或在聚蔗糖溶液中進行密度梯度離心來選擇胚性細胞團,然後轉移到無生長素的培養基上培養,使胚狀體正常發育,這對研究從單細胞到完整植株的胚胎發育過程是非常有利的。
在煙草的組織培養中,采用在培養基中通氯氣或乙烯的辦法可以相應提高細胞同步分裂的百分率。
不同發育階段的胚狀體同步發生的問題受許多因素的製約。在進行胚胎發生及同步控製研究時,應從材料選擇、培養程序及胚胎發生規律等多方麵予以考慮。
(三)人工胚乳的製作
獲得大量發育正常、形態上較為一致的體細胞胚後,就需用適宜的材料對其進行包裹。這些材料提供胚狀體新陳代謝和生長發育的營養物質及生長素等,所以稱為人工胚乳。人工胚乳的製作實質上是篩選出適合該體細胞胚萌發的培養基配方,最後將篩選出的培養基添加到包埋介質中。理想的人工胚乳應對所包埋的胚無傷害;具有足夠的柔韌以包裹和保護胚,並允許其萌發和轉化成苗;有一定的硬度以適應貯藏、運輸和種植等常規操作;可容納和傳遞胚胎發育所需的營養物質、生長和發育控製劑、促進生長的微生物、防腐劑、殺蟲劑等;可以用現有的溫室和農田進行機械播種。在人工胚乳中添加激素雖可提高人工種子的萌發率,但卻會降低幼苗對環境的適應性。人工胚乳應根據各種不同植物的要求和特點有目的、有選擇的配製,而不可隨意套用。