(2)冷凍前的預處理對材料進行抗寒鍛煉或預培養能增強細胞的抗寒力。進行預處理的目的，是使培養物中更多的細胞達到這樣的狀態，即提高分裂相細胞的比例和減少細胞內自由水含量。預處理的主要措施有：
①繼代及同步培養這在懸浮細胞和愈傷組織保存中用得較多。
②預培養指在添加高滲物質或冰凍保護劑的培養基中培養。如菊科茼蒿（ChrysanthemumcoronariumL.）愈傷組織在含10％蔗糖的培養基中預培養若幹天後，再以液氮貯藏，其存活率即可提高。豌豆莖尖生長點在含5％二甲基亞碸（DMSO）的MS培養基上預培養2d，存活率達73％。但蘋果莖尖生長點在含冰凍保護劑的培養基中預培養4d，對提高存活無效應。
③零上低溫冷馴化Seibert和Wetherbee指出，在切取馬鈴薯莖尖進行冷凍保存之前，若先對植株進行4℃低溫處理3d，材料的存活率可由30％提高到60％。
(3)冰凍保護劑冰凍保護劑的使用能減少超低溫保存造成的傷害。保護劑的選擇和濃度以及幾種保護劑的配合方式對細胞存活有很大的影響。如冰凍保護劑可以降低冰點和水的過飽和點，提高玻璃化消失點；增強溶液黏性，阻止冰晶生長，使之較易達到玻璃化狀態；促進結冰早期各階段進行保護性脫水。自發現甘油具有冰凍保護作用後，已有許多物質被用作冰凍保護劑，它們的保護效應不同。使用過的冰凍保護劑有甘油、DMSO、糖類、糖醇、乙二醇、雙乙二醇、丙二醇、環六亞甲基四胺、聚乙烯、吡咯烷酮、三甲基吡啶酮、脯氨酸、聚乙二醇（PEG）等。最常用的是DMSO和甘油，已經證明DMSO是最有效的冰凍保護劑。作為冰凍保護劑，應具備相對分子質量低、易溶於水、低濃度、對細胞無毒害、便於衝洗、進入細胞迅速（對透性保護劑而言）等特性。
在長春花懸浮細胞保存中，用磁共振（nuclearmagneticresonance，NMR）和差熱分析（differentialthermalanalysis，DTA）進行研究的結果表明，含冰凍保護劑的B6培養液，開始結冰和終止結冰的溫度均下降，達到平衡所需的時間延長，且與DMSO濃度成比例。有人認為，水解乳蛋白的保護作用接近DMSO。新近研究發現，細胞內大分子聚合物（主要指蛋白質）可能也具有保護作用。很多研究者發現，使用混合保護劑比單獨使用某一種保護劑效果更佳。混合保護劑的保護作用大小取決於各種成分的組合，其優越性在於各種成分之間具有協同效應和累加效應（毒性不累加）。常用保護劑的總濃度為0.2～2mol/L。加入冰凍保護劑應在低溫下進行，高溫下會增加冰凍保護劑對細胞的毒害。
(4)冷凍一般采用快速、慢速或逐級冷凍法。對於原生質體、懸浮培養細胞、愈傷組織和某些植物的莖尖，宜采用慢速冷凍法，使細胞內的水有充足的時間不斷流到細胞外結冰，達到良好的脫水效應，避免細胞內結冰。通常不同的植物材料對凍害的敏感程度不一樣，因此，降溫的方法也不一樣。常用的降溫方法如下：
①慢凍法是指樣品以0.1～10℃/min的速度降溫，通常用1～2℃/min的速度將溫度降至﹣40～﹣30℃或﹣100℃時，平衡一段時間後轉入液氮。這種方式對懸浮細胞和原生質體比較適應。
②快凍法是指植物材料經玻璃化保護劑處理後，直接放人液氮或其蒸汽相中冷凍和貯存，一般溫度下降的速度為300～1000℃/min。在這樣快的降溫速度下，貯存物很快跨越冰晶形成區，﹣1400℃以下冰晶不再增生，細胞內呈“玻璃化”狀態。在這種狀態時，水分子沒有發生重排，不產生結構和體積的變化，因而不會由於機械損傷或溶液效應，造成組織和召細胞傷害，保證化凍後細胞仍有活力。此法可保存含水量較少的植物材料，如花粉和種子以及高度脫水的抗寒植物的枝條等。
③逐級冷凍法又可分為先慢後快和先快後更快兩種。前一種方法更為常用，它結合了慢凍法和快凍法兩者的優點。起先的慢冷逐漸使細胞失水達到保護性的脫水，形成高濃度的溶質，以防止第2步快凍時受損傷。如甘蔗愈傷組織以l℃/min降至﹣30℃，停留2h以上，存活率很高。楊屬植物愈傷組織降至﹣30℃、﹣70℃、﹣100℃後直接放入液氮，解凍後能再生。
④幹凍法通過控製脫水速度與脫水程度，對植物進行幹燥預處理能增強其抗凍性。植物組織可烘幹、真空幹燥或用其他方法幹燥，然後用液氮貯存，一般認為真空幹燥較好。如石刁柏的腋芽經矽膠幹燥後，投入液氮，凍後存活率為71％，並能再生植株；甜瓜的體細胞胚脫水後直接投人液氮，得到了65％的存活率。幹凍法不需要昂貴的儀器設備，操作簡便，因此不失為一種可行的超低溫保存方法。
⑤滴凍法在鋁箔上的每個滴液中放一個莖尖生長點，包紮後將冰凍液滿於鋁箔上，這樣降溫速度較一致。木薯莖尖生長點采用此法保存已獲得成功。
(5)貯存在植物材料的貯存期間，通常認為不會對植物材料產生傷害。從理論上講，隻要保證能不斷補充液氮，無需再費事就可以長期保存冷凍的材料。但是在這種條件下長期貯存種質的實際效果如何還有待證明。有些文獻報道，隨著保存時間的延長，冷凍莖尖的生活力下降，因此技術上還有待進一步改進。另外，如果貯存的材料較多時，建立有效的記錄製度也是必要的。
(6)解凍貯藏於液氮中的樣品，緩慢升溫時，細胞內會再次結冰，其危險區大概在﹣50～﹣l0℃。因此，理論上要求解凍時迅速通過此區域，避免細胞再次結冰而造成傷害。玻璃化溶液在解凍過程中會發生玻璃化逆轉，當進一步升溫到達重新結冰的溫度時，小的冰晶開始熔化。水分重新分配，形成大冰晶，對細胞有機械損害。快速融冰時，迅速越過再結晶的溫度，次生結冰來不及發生，細胞存活率高。很多實驗表明，冰凍過的植物組織培養物在35～40℃水浴中解凍比在室溫（25±2℃）下解凍效果好。但有些研究結果與此並不一致，如鬆樹針葉冷至﹣45℃後，以5℃/h解凍能存活，而以10℃/h解凍的則致死；玉米和胡蘿卜細胞，室溫（20℃）和40℃下解凍的存活率相同；梧桐槭（Acerfirmianioides）細胞在40℃與0℃下解凍後的TTC還原值無差異。冰凍後的組織和細胞很脆弱，解凍時應避免劇烈搖動。解凍後的樣品應置於冰浴中，以防止高溫下冰凍保護劑的毒害。在35～40℃水浴中解凍時應防止過熱傷害，待冰解凍後即可取出。
(7)解凍後的處理材料解凍後的後處理可保證其在最佳條件下得以迅速恢複，解凍後殘留於細胞內的冰凍保護劑會影響冰凍材料的恢複和繼續生長，因此大多數情況下需要除去冰凍保護劑。在實際應用中沒有必要將細胞內保護劑徹底除去，因為連續的清洗常會進一步損傷細胞。洗滌的傷害可能與去質壁分離和胞質平衡失調有關。如在白三葉草和甘蔗中，已觀察到不清洗能提高存活率，增加正常苗形成的比例。因此，解凍後洗滌與否隨培養物而異。在采用稀釋法除去防凍劑時溫度和洗出速度很重要。