生物體的遺傳物質從親代傳給子代,攜帶遺傳物質的材料稱為種質。這種攜帶遺傳物質的材料,包括植物種子、根莖、塊莖、樹木、苗木等,統稱為種質資源,也稱為遺傳資源(geneticresources)或稱基因資源(generesources)。狹義上講,生物種質資源包括全部動植物家養品種、地方品種、新育成動植物品種以及重要的育成品係和遺傳材料;廣義上講,種質資源是指地球上所有生物種質的遺傳多樣性資源。包括數以萬計的動物、植物、微生物和它們所擁有的基因,即包括全部動植物野生物種。狹義的生物種質資源具有在其進化過程中形成的基因及其原始基因,是現代動植物改良及農業生產和科學研究的物質基礎。植物細胞具有全能性。離體的植物細胞,不管是體細胞還是生殖細胞,在合適的條件下可誘導出完整的再生植株。這樣通過保存植物細胞、組織、器官,即可達到保存種質資源的目的。藥用植物的種質資源廣義是指一切可用於藥物開發的植物遺傳資源,是所有藥用植物物種的總和。狹義的是某種中藥材(有效成分)的植物遺傳資源。種質資源是提高中藥材質量的關鍵和源頭,保證中藥產業可持續發展的根本措施。
一、種質資源保存概述
利用組織培養技術保存種質資源利用了相對小的空間內保存大量的種質,並可免遭自然狀態下病蟲害的襲擊;對於一些特殊的材料,如遠緣雜種的不育後代以及體細胞雜種植株等,更適合於用該方法保存;另外,這種方法保存的種質便於交換和發放,減少檢疫手續。有關這類保存的具體方法很多,按其原理大體可分為以下幾類(梁永恒,等.1999年):①常溫繼代保存。即在常溫條件下,將培養材料進行繼代保存,所用的溫度是培養室的常用溫度或自然溫度。繼代時間隨培養物的類型、培養溫度和容器大小而定。②低溫保存。即利用低溫對植物生命活動有抑製作用的原理而進行保存的方法。所用溫度一般為1~10℃。此方法適合於保存耐冰凍植物的種質材料,不適合於冷敏感植物,如曼陀羅(Datura)和紫蘇屬(Perilla)植物,冷貯藏後就不能存活。③低氧保存。就是利用生命活動離不開氧氣,降低氧含量會使細胞代謝緩慢的原理來保存植物種質的方法。如采用礦物油覆蓋或減少容器內氧濃度均可達到保存種質的目的。④幹燥保存。就是利用適當降低細胞中水分,細胞代謝隨之降低的原理來保存植物種質的方法。用於幹燥保存的植物組織在ABA和0.15mol/L的蔗糖培養基上預培養後再幹燥,有利於細胞的存活。⑤添加生長調節劑保存。該方法采用生長延緩劑或抑製劑延緩或抑製細胞增長。常用的延緩劑有矮壯素(CCC),丁酰肼(B9)、多效唑(PP333),生長抑製劑有脫落酸(ABA)等。⑥壓保存。顧名思義,即在比較低的壓力下保存植物組織。低壓保存的原理尚不清楚,一般超低溫保存的藥用植物材料包括:生長點、體細胞胚和花粉胚、懸浮培養細胞和愈傷組織、原生質體等。
二、種質資源的超低溫保存
(一)種質資源超低溫保存的概念及原理
1.概念
種質資源超低溫保存是指在﹣80℃以下的超低溫中保存種質資源的一整套生物學技術。超低溫常用幹冰(﹣79℃)、深冷冰箱、液氮(﹣196℃)及液氮蒸汽相(﹣140℃)獲得。由於冷源通常選用液氮,因此超低溫保存又稱液氮保存或LN(﹣196℃)保存。從理論上來說,在超低溫條件下保存材料,可以大大減慢,甚至終止代謝和衰老過程,保持生物材料的穩定性。最大限度地抑製生理代謝強度,降低劣變發生頻率,達到長期保存種質的目的。超低溫保存種質時用液態氮作冷源,液氮罐就是冷凍器和貯存容器,除了每隔40~60d補充1次液氮外,不需機械空調設備及其他管理設施,所需費用低於低溫種質庫,這樣就免去了檢測活力和繁殖更新等繁雜程序,從而節約了人力、物力。
2.原理
生物細胞在降解過程中,隨著溫度的降低,細胞外介質結冰,而細胞內尚未結冰,造成細胞內外蒸汽壓力差。隻要降溫速率不超過脫水的連續性,細胞內水不斷向細胞外散,細胞原生質濃縮,從而降低細胞內含物的冰點,能有效阻止細胞質和液泡中結冰。但過度的脫水會使細胞內有害物質積累,蛋白質分子之間形成二硫鍵,破壞蛋白質、酶、膜的完整性以致種子受到傷害。有人認為,植物體內的水在降溫冷凍的過程中,從﹣10℃到﹣40℃是冰晶形成和增長的危險區,在﹣140℃以下冰晶不再增長。如果降溫速率非常快,細胞液“固化”,但仍保持非結晶狀態,這種現象被稱為“玻璃化”,對細胞不構成直接傷害。從理論上說,細胞內含物一旦發生玻璃化,就能避免細胞內結冰。有兩種方法可使水容易玻璃化,即加入高濃度大分子量冰凍保護劑或增加壓力。
(二)種質資源超低溫保存的程序和影響因素
1.種質資源超低溫保存的程序
植物器官或組織細胞的無菌培養→經過預處理後,加入冰凍保護劑→以適當速度冷卻或經預處理之後置於液氮中→培養物在液氮中貯藏→解凍→反複衝洗,除去冰凍保護劑→檢定生活力→對恢複活力的培養物再培養→誘導生長或再生植株。其大體的程序如圖7-1所示。
植物組織細胞和器官
預處理
(加速傳代、提高培養基滲透壓、低溫鍛煉)
加冰凍保護劑
預凍法慢凍法快凍法
(﹣20℃或﹣70℃)(降溫速度1~5℃/min)(降溫速度300~1000℃/min)
﹣40℃或﹣100℃
種質庫(﹣196℃)
迅速冷凍(30℃~40℃)
除去冰凍保護劑
活力檢測
再培養
細胞生長或植株再生
圖7-1種質資源超低溫保存的一般程序
2.種質資源超低溫保存的影響因素
植物種質超低溫保存效果的因素很多,如果其中某個環節處理不當,就可能影響整個係統的成功,影響存活率。這些因素主要包括如下幾點。
(1)植物材料的特性冷凍前植物材料基因型的差異以及植物組織、細胞培養物的生長年齡與生理狀態是決定冷凍細胞生活力的最重要因素。一般來說,高細胞質、無液泡、薄壁的小分生細胞的存活率高於含大量液泡的大細胞;取延滯生長後期或指數生長期的細胞培養物能得到最高的存活率,因為這時多數細胞處在比較理想的狀態(指細胞質濃厚,細胞抗性強)當中。此外,凍後細胞的恢複生長依賴於保持分裂能力的細胞濃度,即高密度細胞是細胞存活力的重要指標。另外,細胞團體積大小本身對冰凍保存效果也有影響,體積過大或過小(如遊離細胞)冰凍保存效果都不好。