正文 第三節藥用植物的細胞突變體育種(3 / 3)

b.抗抗生素藥物突變體植物細胞突變體中研究得最多的就是抗抗生素突變體。鏈黴素(streptomycin,Str)、卡那黴素(kanamycin,Kan)和氯黴素(chloramphenicol,chloromycetin,Chi)等能區別性地作用於原核生物和真核生物轉譯係統。例如Str和Kan對原核生物70S核糖體有效,而真核生物中隻有線粒體和葉綠體中有這種核糖體,因此在真核細胞中對這些藥物的抗性特征是以細胞質遺傳的。Maliga等(1973年)最先分離到煙草Str抗性細胞係。由於低濃度的(250~500g/ml)Str能抑製愈傷組織細胞中葉綠體類囊體的形成,因而再生出的幼苗呈白色。這樣可根據愈傷組織的顏色分離Str抗性細胞係,對Str抗性突變體SR,(第1代)進行遺傳學和生化測定,表明其抗性是通過細胞質遺傳的,SR1和Str敏感細胞的葉綠體核糖體蛋白質雙向電泳分析指出,它們之間至少有一種蛋白質有差異。用原生質體融合方法將SR1的葉綠體轉移到另一煙草種中進一步證明,Str抗性特征是由於葉綠體上一蛋白質的基因突變所致。另外,Str抗性特征也能按盂德爾方式以隱性核基因遺傳。

c.抗除草劑突變體Chaleff(1978年)將培養的煙草細胞植板在加有除草劑4-氨基-3,5-三氯吡啶羧酸(picloram)的培養基上,分離出抗該除草劑的煙草突變體。從5個抗性細胞係得到了再生植株,其中有3個屬於單個核基因的顯性突變,而另2個則是半顯性突變。試管苗及其愈傷組織也都具有抗性。他們還從花藥培養的單倍體煙草幼葉發生的愈傷組織中篩選到兩種抗磺酰基脲類除草劑的突變體,再生植株也具有相應的抗性。這種抗性是以單個顯性或半顯性的基因突變遺傳的。選擇抗除草劑突變體的目的在於得到能用價廉高效除草劑的新品種。

d.抗病突變體Carlson(1973年)將單倍體煙草的細胞或原生質體經誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理後,培養在加有選擇劑蛋氨酸磺基肟(野火病毒素類似物)的培養基上,由於存活的細胞產生抗性愈傷組織並分化成植株,它們對煙草野火病病原體的感染均不敏感,有些植株體內蛋氨酸含量比親本增加了5倍。Gengenbach等(1977年、1975年)用玉米小斑病毒素選擇玉米抗病突變體,該抗性是細胞質遺傳的,並由線粒體DNA編碼,該抗性突變體失去了原先親本的雄性不育特征。除了上述各類突變體外,還有抗核酸堿基類似物的突變體,碳源利用突變體,激素自養型突變體,溫度敏感突變體,耐鹽,耐旱等環境脅迫的突變體等。

(2)植物突變體的誘發和篩選以抗病突變體的誘發和篩選為例介紹操作過程。

應用體細胞無性係變異進行抗病育種的方法是不經體外選擇,直接對組織培養再生的植株或苗進行抗病檢測。對於表現抗病性狀的植株,這種抗性穩定性需要對大田環境下幾個營養世代繼續連續抗病檢測才能作出評價。下麵以枸杞(LyciumbarbarumL.)為例介紹抗病突變體(抗根腐病變異體)篩選的具體操作步驟。

①植物材料寧杞1號的髓組織。

②愈傷組織誘導取當年生長的明顯分化成髓組織的枝條,摘除葉子、側芽和帶有100mm的頂端分生組織,把外植體的切端傷口處用熔蠟封住,然後浸入70%乙醇中20s,再轉入0.1%升汞溶液中8~10min,用無菌水衝洗3次,最後用吸水紙吸幹,用解剖刀從莖的兩端各切除10mm,餘下部分切成20mm的小段,用無菌鑷子夾著莖的切段,用瓶塞打孔器從切段中取出圓柱狀髓組織並將其轉移到90mm的無菌培養皿中,用解剖刀切成2~3mm厚的小圓片,接種到MS固體培養基上進行胚性愈傷組織的誘導。

③愈傷組織的誘變用60Co-γ射線的半致死劑量處理胚性愈傷組織,然後轉入誘導培養基中使其恢複增殖。

④抗性愈傷組織的篩選將培養14d後存活下來的胚性愈傷組織轉移至含60%枸杞根腐病菌製成的毒素誘導培養基中培養,28d後將少數存活下來的愈傷組織轉移至含30%的同樣培養基中培養,每21d轉接1次,共繼代14代,經不斷選擇,選出了耐30%毒素的愈傷組織變異體。

⑤抗性植株的再生將愈傷組織變異體接種於含30%毒素的分化培養基(MS+6-BA0.2mg/l)上培養,28d後接種在生根培養基(MS+NAA0.2mg/l)上誘導生根,獲得抗性再生植株。

⑥抗性植株的鑒定經苗期生理生化指標分析,室內葉片經根腐菌分生孢子液接種鑒定,表麵再生植株是抗病突變體。

(3)體細胞無性係變異的檢測常采用形態觀察、細胞遺傳學(如核型)分析、次生代謝物含量、同工酶或分子標記進行檢測。由於體細胞無性係變異可能在不同水平(如整株、細胞、分子)上發生。因而這些檢測手段不僅同所發現的體細胞無性係變異的類型相關,而且也常用來探討體細胞無性係變異發生機製及這些不同水平上的變異之間的相互聯係等。

①形態檢測形態檢測是最常用的檢測體細胞無性係變異的方法,但利用形態觀察很難區分變異是否為遺傳變異或非遺傳變異。即使是可遺傳的變異,單或多基因性狀可能並非純合,有時屬生化特征或形態特征難以區分,多基因性狀又會因遺傳力低、基因型與環境互作影響而增加其複雜性。

②細胞遺傳檢測對染色體的數目和形態特征進行檢測也是一種經常采用的檢測手段。但染色體數目與結構變異具有隨機性,而且不能用基因座和等位基因模型來解釋,染色體數目雖然高度遺傳,但是不同特化組織類型因組織內存在內多倍性(endopolyploidy)而使檢測到的染色體數目存在差異。另外,體外培養中產生的染色體數目和結構變異又常與培養類型有關,例如Griesbach和Larkin記載了體外培養中誘導出的染色體數目與結構變異,幾乎都與基於脫(未)分化的組織或單細胞的培養方式相聯係。

③次生代謝物含量和種類檢測對次生代謝物含量和種類檢測主要在大規模細胞培養產生植物次生代謝物中進行,在對一般體細胞無性係變異的檢測則較為少用。另外,次生代謝物如花青苷或黃酮等色素由於其複雜的生化合成,也不能用基因座和等位基因模型來解釋。

④分子檢測近年來,普遍采用同工酶和分子標記對體細胞無性係變異進行檢測。主要有同工酶、限製性片段多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、微衛星(micorsatellite)或簡單序列重複(simplesequencerepeat,SSR)等檢測手段,有關這些技術的原理和大體操作流程,見本書第九章相關內容。值得注意到是,盡管分子標記與表型變異相對應的情況較少,但分子標記技術仍然是分析體細胞無性係變異的有效工具。