(4)植株的生理狀況據Sunderland研究，煙草開花早期時的花藥要比後期的更容易產生花粉植株，大約在始花期後6天花粉胚的誘導率最高。開花後期的花藥不易培養的原因可能是花粉的能育性下降。花粉植株的誘導率還與母體植株的生長條件有關。Sunderland（1978）發現讓植株長期處於氮饑餓狀態下可以顯著的提高其花藥的培養成功率。不施氮肥的植株無論是花藥培養還是每個花藥的胚胎產率均高於施氮肥的植株。我國的科研工作者曾發現，在高緯度、高海拔地區栽培的小麥花藥培養的成功率較高。早春播種的冬小麥比秋播的花粉植株誘導率高。
(二)應用子房培養技術培育單倍體
子房培養育種是將子房內胚囊中的單細胞培育成單倍體植株，再經染色體自然或人工加倍得到純合二倍體的一種育種方法。未授粉子房培養得到的植株是單倍性的，子房培養應用於育種上也可稱為單倍體育種。國際上首例報道未授粉子房培養出單倍體植株的是大麥（Hordeumvulgare），接著是小麥（TriticumaestivumL.）、煙草（NicotianatabacumL.）、黃花煙草（NicotianarusticaL.）、水稻（OryzasativaL.）、向日葵（HelianthusannuusLinn.）、玉米（ZeamaysL.）。利用子房培養進行中草藥單倍體的培育剛剛起步，隻有少數成功的例子。
1.子房培養的基本原理
子房（ovary）是雌蕊基部膨大成囊狀的部分，由子房壁（ovarywall）、胎座（placenta）、胚珠（ovule）所組成，子房將來發育成植物的果實。子房中存在著兩種細胞——體細胞和性細胞，體細胞是二倍體細胞，包括組成子房壁、胎座和胚珠壁的細胞，性細胞是單倍體細胞，包括胚囊裏的卵細胞（未受精）、助細胞、極細胞和反足細胞。這些細胞都有產生胚狀體和愈傷組織，進而發育成植株的能力，即再生植株既可起源於體細胞，也可起源於性細胞。子房培養（ovaryculture）指將子房從母體植株上摘下，放在無菌的人工環境條件下，讓其進一步生長發育，以至形成幼苗的過程。根據子房是否授粉，將子房培養分為授粉和未授粉子房的培養兩類。培養授粉子房的目的是想挽救子房內雜種胚的發育，培養未授粉或未受精子房的目的是想通過子房內胚囊中單細胞的發育獲得單倍體植株。在進行未授粉子房培養時，若產生植株的細胞，是由珠被或子房壁表皮細胞發育而來，這些細胞都是二倍體組織，因而產生的植株，自然是二倍體的了，這些植株在遺傳組成上與母體相同；若產生植株的細胞是由卵細胞（未受精）、助細胞、極細胞和反足細胞起動的，並產生原胚細胞，由原胚細胞發育成胚狀體或愈傷組織，再進一步分化出芽和根，最後形成小植株。則形成的植株為單倍體植株，這些植株經染色體加倍後即可培育成正常結實的純合的二倍體植株。
2.子房培養的單倍體育種技術
子房的單倍體育種技術與花藥（花粉）的單倍體育種技術基本相同，隻是培養時所用的外植體不同。下麵主要介紹子房植株誘導和再生的具體過程。
(1)取材培養未授粉的子房，一般在開花前1～5d將大田中種植的植株的子房摘下即可。
(2)消毒若植株的子房包裹在穎花裏，穎花又嚴密包裹在葉鞘裏，則不需要用藥劑進行消毒，隻在幼穗表麵用70%乙醇擦拭即可。若植株的子房暴露，則應進行嚴格的消毒。一般先將子房放在70%乙醇裏浸泡30s，用無菌水衝洗3次後，再在0.1%的升汞中消毒15～20min，用無菌水衝洗3次，濾紙吸幹備用。
(3)接種經消毒的材料置於超淨台上，在取子房中的胚珠時，應注意器具盡可能不碰傷胚珠。子房也可直接接種到培養容器中，5～100ml中的三角瓶是最常用的培養器皿，每瓶一般接種10～20個子房。
(4)培養各種植物未授粉子房培養所用的培養基，因植物的種類不同而不同。
采用固體和液體培養均可，固體培養時應將子房平放在培養基上，液體培養時應在液體培養基上加濾紙橋。在無菌條件下剝開幼花，用鑷子夾出子房進行接種，或直接接種到培養基上。培養穩定為26℃左右，50～60%相對濕度，每天16h散射光照。
(5)子房植株的再生離體未授粉子房在培養基上培養一段時間後，一般2～4
周長出愈傷組織或胚狀體。取誘導出的胚狀體，轉接到再生培養基中繼續培養，即可在線未授粉子房開裂處見到許多淡黃色的胚狀體，胚狀體見光後變綠，並逐漸發育成小苗。如子房經上述培養後形成愈傷組織，則將這種愈傷組織（直徑1mm）及時轉移到合適的培養基上，即可誘導形成芽、根，並發育成植株。
3.子房培養形成單倍體植株的影響因素
主要有植物的品種差異、胚囊的發育時期、外源激素等。
(1)植物的品質差異在水稻、小麥、大麥、煙草、向日葵等未授粉子房的培養中發現，誘導子房產生單倍體植株的頻率與植物種類和品質有關，也就是說成功與否與基因型有關。
(2)胚囊的發育時期培養子房時，未授粉子房的發育時期，即胚囊的發育時期與子房的誘導頻率密切相關。從研究得較多的大麥和水稻來看，在胚囊發育的各個時期都可以觀察到培養子房內胚囊中單細胞的變化，但以接近成熟的胚囊時期的子房裏的單細胞最容易誘導出完整植株。水稻中觀察到處於四核期胚囊到成熟期胚囊的子房，培養時其誘導頻率較高，而處於單核期胚囊的子房，培養時沒有觀察到子房的變化。所以選擇合適的胚囊發育時期是子房培養成功的關鍵因素。
(3)外源激素子房培養時，為了使子房中胚囊內的單倍體細胞發育，在培養基中加入一定量的外源植物生長調節劑是完全必要的。例如，水稻的子房培養在不加外源植物生長調節劑時，多數子房不膨大或不產生愈傷組織，若加入0.125mg/L的2,4-D，可明顯促進子房的膨大，產生愈傷組織。又如在大麥的子房培養中，在培養基中加入0.5mg/L的2,4-D1mg/L的NAA和1mg/L的KT，可誘導子房形成胚狀體，再由胚狀體形成單倍體植株。
四、藥用植物單倍體育種的應用實例
以石刁柏單倍體育種為例。
石刁柏（AsparagusofficinalisL.），俗稱蘆筍，屬百合科（Liliaceae）植物。經測定，石刁柏含有較多氨基酸、礦物質、甾體皂苷、酚類物質和微量元素——硒、鉬、鉻、錳等，具有調節機體代謝，提高機體免疫力的功效，在醫療上有較高的價值。它能助消化，增強食欲和體力、降低血壓，對消化、泌尿、循環、淋巴係統疾病和神經痛、視力衰退、白血病等病變均有一定療效；並對高血壓、心髒病、心率過速和消除疲勞、水腫、膀胱炎、排尿困難、腎結石和直腸癌亦有療效。石刁柏為雌雄異株植物，雄株莖粗而雌株細小，因此雄株產量高、品質好。如果田間全係優良品質的雄株，就可大幅度地提高石刁柏的產量。因此培育全雄係品種早已成為國內外石刁柏育種的重要目標。石刁柏的性別遺傳特點是雌株純合型，基因型為xx，雄株雜合型，基因型為xy。雌雄異株植物在正常育種程序上較難獲得純係，而利用雄株的花藥進行離體培養，可以得到由x和y兩種配子型花粉發育而來的單倍體植株，這種植株經染色體加倍後，獲得yy的純雄株或叫“超雄株”和xx超雌株。用超雄株和雌株雜交，F1代全部為雄株，稱“全雄係”。Falavigna（1986年）得到的“全雄係”雜種比標準品種增產60～100％。利用石刁柏花藥進行離體培養是花藥培養技術培育純係較成功的例子，現簡要介紹一下實驗方法。
(1)培養材料選擇花蕾長為1.5～2.2mm，花粉發育處於四分孢子體時期的花藥。
(1)花藥培養的基本過程
①花藥的采集石刁柏雄花花期較長，從最初的4月中旬到9月下旬均可采集，但以4月中旬到5月上旬采集的花藥最好。采集花藥時，先將紗布煮沸消毒，再把花蕾連同花梗在70％乙醇中浸20s，用無菌水衝洗3次，再用冷卻消毒過的紗布包裹花蕾和花梗。為了防止水分散失，材料應裝在用乙醇消毒過的薄膜袋內。
②預處理將采集的花藥放置於光照培養箱（黑暗）中進行預冷凍處理，石刁柏花藥低溫和冷凍的最佳搭配方案為4℃、4d。
③愈傷組織的誘導誘導愈傷組織的基本培養基配方為：MS+3％蔗糖+0.7％瓊脂（pH5.8）。在激素配比上，不同學者報道的結果不同。Yakuwa（1972年）認為附加6-BA1.0mg/L、NAA1.0mg/L誘導愈傷組織的效果較好；Torrey（1983年）認為附加6-BA1.0mg/L、NAA5.0mg/L誘導頻率最高；張磊等（1990年）認為NAA0.1～0.5mg/L、6-BA1.0～2.0mg/L、2,4-D0.5～1.0mg/L是最適宜的。Pelletier（1972年）對石刁柏花藥愈傷組織進行培養，發現高濃度的KT會導致愈傷組織多倍化。許多學者進行石刁柏花培養，所使用的激素包括2,4-D、NAA、6-BA和KT，應用不同濃度配比的培養基，在所獲得花粉愈傷組織中均出現不同程度的混倍化。2,4-D1mg/L以上會使愈傷組織多倍化加9倍，為此應在誘導培養基中應盡量降低2,4-D的濃度或用其他外源激素代替。花藥經過25～30d的培養，陸續產生愈傷組織，一類是鬆散型愈傷組織，其特點是質地疏鬆，為黃白色，稱I型愈傷組織。接種後4～6d由花藥表麵細胞產生的，稱為I早型愈傷組織；接種後20d由褐色幹枯花藥內部產生的愈傷組織，稱為I晚型愈傷組織。另一類是緊密型愈傷組織，稱為Ⅱ型愈傷組織，此類愈傷組織質地緊密且生硬，呈白色或黃白色，於接種1～3周後陸續出現。這類愈傷組織，多由花藥頂端及中部從裏往外生出，還有部分是由花藥兩側的藥囊產生。進一步觀察發現最先出現的I早型愈傷組織是由花藥體細胞發育而來，而I晚型和Ⅱ型愈傷組織大部分是從花粉粒發育而來，出現相當數量的單倍體細胞。
④愈傷組織的分化當愈傷組織長至米粒大小時，轉到分化培養基（MS+2,4-D1.0mg/L+NAA0.2mg/L+6-BA0.2mg/L）上，分化培養基上愈傷組織分化形成芽。
③花藥植株根的誘導石刁柏苗的生根比較困難。陳穗雲等（1998年）研究表明，石刁柏花藥來源的試管苗莖尖切段基部根原基的發生和根原基發育形成根是兩個不同的階段。較低濃度的NAA（0.01mg/L）和充分的養料供應使莖尖切段基部內源ABA持續下降，是切段基部形成愈傷組織並在其中分化出根原基的必要條件；而相對的水分缺乏和進行有效的氣體交換則使內源ABA迅速上升，促進根原基進一步發育形成根。每個階段用不同的處理可使生根率達100％。
④花藥植株的染色體檢查石刁柏的染色體數為2n=20，其染色體組是x=10，染色體中有5個長染色體，1個中間染色體和4個短染色體。多數實驗表明，通過花藥培養途徑誘導產生的單倍體植株的頻率較低，再生植株倍性變化複雜，其染色體範圍變異較大，包括n、2n、3n、4n、6n、和8n的細胞，因而獲得再生植株後，在進行根尖壓片法進行染色體的檢查後，才能確定是否為單倍體植株。石刁柏的性別決定是xy型，x染色體為具亞端著絲粒染色體，y染色體是具中間著絲粒染色體。因此，可以通過細胞學的方法來進行雌株和超雄株鑒定。
⑤花培品係農藝性狀的觀察石刁柏是多年生植物，它的食藥用部分是營養體（嫩莖），它的出莖數、莖長和莖粗等農藝性狀與產量是相關的，因而在選育優質、高產品種時，應注重選育出莖數多、莖粗的品種。