(2)材料的預處理為了能提高愈傷組織和苗的分化頻率。常常要進行預處理。主要方法為低溫處理，花蕾接種前冷處理能提高獲得單倍體植株的頻率，例如肖昌華等在進行石刁柏（AsparagusofficinalisL.）花藥培養時發現不論是同一低溫下不同處理時間，還是同一時間下不同冷凍溫度，與對照相比均明顯提高了石刁柏花粉愈傷組織誘導頻率。從試驗結果看，花藥冷處理對溫度要求並不嚴格，但對處理時間要求較高。溫度與時間的最佳方案為4℃、4d，誘導頻率高達83.75%，比對照提高了60.33%。目前對花藥冷處理一般采用10℃以下2d到20d。除此以外，還有乙烯處理、輻照、高溫、變溫、黑暗或生長素等處理，對於培養也有好處。
(3)材料消毒取回的花蕾或幼穗等材料在接種前進行表麵消毒滅菌，一般用70～75%酒精在表麵擦拭或浸一下，然後在飽和的漂白粉溶液中浸10～20min，或用0.1%的升汞溶液消毒7～10min，用無菌水衝洗3～5次即可，在操作熟練的情況下，也有僅用70%酒精將花器表麵擦淨即取出花藥的。
(4)接種在無菌接種室或超淨工作台上進行接種操作,采用直徑3cm的試管，每管接種花藥30～60粒。在無菌操作取花藥時，注意不要碰傷花藥。剝取後的花藥，用鑷子或接種針接入預先配製好的培養基上。花藥剝離的無菌操作技術可按個人的方便，自己創造摸索一種適合的方法。應保持環境的衛生和清潔。接種時速度要快，盡量減少花藥在外空間停留的時間。直接取出花藥投入培養基的效果也很好。接種時，花藥密度以較密為好，常常觀察到集體效應，即接種密度高時愈傷組織的誘導率也高，這可能是由於花藥組織分泌的活性物質互相作用的結果。
(5)培養接種後要進入培養室中進行恒溫培養。培養分脫分化培養和再分化培養，脫分化培養是指，選取適宜的基本培養基和適當的生長素比例進行培養，經10～30天誘導愈傷組織形成。而再分化培養則是指愈傷組織增殖到1～3mm大小時，及時進行轉移到新的適宜的培養基中，選擇適當的激素水平進行培養，進行誘導成苗，以獲得花粉植株。這時要約經20～30d就能誘導苗的分化。
在培養的過程中，培養室的溫度一般保持在25～28℃。在培養的過程中要定期的觀察。離體花藥培養一段時間後，如果培養基和培養條件適宜，一般在2周到一月左右即長出愈傷組織或胚狀體。
但許多植物的花藥並不形成胚狀體，而是形成愈傷組織。當這種愈傷組織及時轉移到合適的培養基上時，即可誘導形成芽、根器官，並發育成植株。如水稻、小麥、大麥、玉米等。愈傷組織的及時轉移對分化頻率的影響極大，故而宜早不宜遲，因為分化能力隨著愈傷組織的生長而下降。以水稻為例，一般在愈傷組織生長到直徑為1mm時轉移，其分化頻率最高；過大其分化頻率將顯著的下降。
培養基中的激素的狀況，對培養的花藥是產生胚狀體還是產生愈傷組織起著巨大的作用。一種植物可以在一種培養基上產生胚狀體，而在另一種培養基就有可能誘導出愈傷組織。例如水稻通常在含有生長素的培養基上長出花粉愈傷組織，但在不含有任何激素的N6培養基上，卻可直接誘導出花粉植株。
(6)花粉植株的移植當花粉植株來自於花粉胚的情況下，小植株直接從花藥囊中長出。例如在煙草上每一個花藥可產生200株以上的花粉植株。小苗往往擠成一團，莖葉細弱，根係不發達，不能直接移植到土壤中去。需要進行一次分苗移植。移植在無菌條件下進行，將小苗單稞或數稞一束移植到不含任何激素的培養基中，待小苗長出4～5片真葉和一些根係時，就可移植到花盆或苗床中，移植後蓋上玻璃器皿或套上塑料罩以保持一定的空氣濕度，有利於小苗的成活。如果是誘導產生愈傷組織，應轉移到分化培養基上誘導芽和根。如果苗幼小可以通過二級培養使幼苗生長茁壯，H和MS基本培養基可用於雙子葉植株的壯苗，而N6基本培養基可使禾本科幼苗產生大量的不定根。根係發達後可以進行移栽。
(7)染色體的加倍除充分利用其自發的核內有絲分裂產生的二倍體外，當產生的是單倍體植株時，就要通過人工方法進行染色體加倍。常用的方法是用0.02～0.4%秋水仙素處理植株，雙子葉植物處理生長點或芽，禾本科植物在分孽期處理分孽節。以煙草為例，最簡單的辦法是處理單倍體小苗，即在分苗二次培養之前，將小苗在無菌的0.2～0.4%秋水仙素溶液中浸泡24～28h，用無菌水洗三次，然後再移植到新的培養基上。經過處理的幼苗，初期生長速度減慢，但經過一段時間的培養後可恢複生長。用這種方法大約20～25%的小苗可成為二倍體。
3.花藥培養方法的種類
花藥培養的方法有兩種，一是瓊脂固體培養法，二是液體培養法。
(1)瓊脂固體培養法在培養基中加入0.5～0.8%瓊脂，使培養基呈半固體狀態。加入的瓊脂因瓊脂質量而定。根據一般經驗，瓊脂濃度一般以花藥有三分之一浸入而又不沉沒於瓊脂中為宜。
(2)液體培養法在培養基中不加入瓊脂，直接把花藥接入呈液體狀態的培養基中。液體培養基是一薄層（約0.5cm液層），若能讓花藥漂浮在液麵上，效果最好。因此，高國楠（華裔加籍科學家）等發明在培養基中加入聚蔗糖（Ficoll），可使花藥全部不下沉而漂浮在液麵上，這樣通氣良好，提高了培養效果。但在液體培養時，要特別注意及時轉移沉於瓶底的長大的愈傷組織，否則會影響再分化培養的效果。
具體的作法如下：①用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾液體培養基。②在無菌室中，將液體培養基分裝在經高壓滅菌過的25～50ml三角瓶中。③將花藥直接接種於液體培養基上，使它漂浮在液麵。④定期加入新鮮培養液。
水稻花藥接種在這種液體淺層上，10d後就可在培養液中見到大量乳白色半透明的小愈傷組織；而在固體培養條件下，則要經20多天才能看到肉眼可見的小愈傷組織。
4.影響花藥花粉培養成功的因素
花藥、花粉的培養雖然已是一項成功的技術，但要獲得良好的效果，特別是對那些難培養的作物來說，培養效率往往是限製花藥花粉培養在這些作物上應用的主要阻力。因此，探討影響成功的關鍵因素，一直受到眾人的關注。影響花藥花粉培養的因素很多，我們要從以下幾個主要的因素進行介紹。
(1)材料的基因型不同的植物，對花培的反應極為不同。不同科之間有差異，同科中不同屬也有差異，甚至在同科同屬同種中的不同亞種中也有很大的差異。一般茄科的植物花藥培養容易成功，而棉花、大豆的花藥培養卻至今尚未成功。同屬禾本科，水稻比大麥的培養效果好，水稻中粳亞種又比秈亞種易於成功。愈傷組織的誘導率前者可達40～80%，而後者僅約2%。基因型的差異給花藥培養在育種上帶來一定的困難，限製了對材料的廣泛利用。但這一問題可以通過調整培養條件和其他因素而逐步加以解決。
(2)花粉的發育時期接種花藥的花粉發育時期，是決定花藥培養能否成功的關鍵因素。在花藥培養中早已發現，隻有培養花粉發育到一定時期的花藥，才對外界刺激最敏感。因此，不是任何時期的花粉都可在離體培養條件下誘導產生愈傷組織或胚狀體。而不同植物的花粉對外界的刺激的敏感時期是不同的。如水稻、煙草的花粉，從單核中期到雙核期皆可接受誘導，而小麥、玉米的花粉，以單核中期為佳，番茄、大麥則還要更早些。不過大多數的植物在單核期特別是中後期比較敏感，所以進行花藥培養未成功的植物，最好取單核期的各個時期的花粉進行培養，有利於獲得成功。
(3)培養基的作用
①應用於花藥培養的培養基花藥培養同其他組織或器官用的培養基是一樣的，主要是MS培養基、N6、Miller、B5、Nitsch等，其中應用較廣泛的是MS基本培養基，其他培養基是在其基礎上修改而成。不同植物種類對基本培養基的要求有所不同。如在煙草花藥培養中，Nitsch培養基效果較好，而水稻花藥培養用Blaydes培養基。N6培養基在水稻、玉米等作物上也有良好的效果。在小麥上，通常應用的是MS培養基。一些十字花科的植物（甘藍、油菜）的花藥培養，則常使用MS培養基和B5培養基。
②激素的作用在培養基中，起關鍵作用的主要是激素，在所有實驗中，隻有煙草花藥能在無激素的培養基上產生大量的花粉胚和植株。一般來說，花粉可通過胚胎階段或愈傷組織階段形成植株。花粉究竟是發育為胚還是愈傷組織，在很大成都上取決於培養基中激素的種類和濃度。植物生長素類物質對誘導細胞脫分化形成愈傷組織及其生長有決定性作用，而細胞激動素類物質愈傷組織的分化和胚狀體的形成起主要作用。所以，在花藥培養中也往往通過調整兩者的比例來控製花粉細胞的脫分化和再分化。生長素類物質中，廣泛使用的是2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸），在細胞分裂素物質中，較為常用的是激動素。兩者的效果都很好。
③糖對於花藥培養的作用糖對於花藥的培養也是不可缺少的。糖的作用主要是提高碳源和調節滲透壓的作用。在花藥的培養中，曾觀察到不同的糖的濃度與花粉發育成苗有密切的關係。在煙草的花藥培養中，蔗糖的濃度在1～3%的範圍內，隨著濃度的增加，出苗率也增加。當濃度達到3%時出苗率達到39.06%，這時的幼苗也較健壯。而當濃度達到4%時，出苗率降到17.72%。在花藥培養中，蔗糖濃度一般以2～5%為宜。但有些作物在誘導花粉愈傷組織時需要較高的濃度的蔗糖，如大麥、小麥等需9%左右。但在分化培養基中，蔗糖的濃度不宜太高，一般在3%左右，太高不利於苗的分化。
④有機附加物一些有機附加物對於花粉發育也有著一定的作用。例如，水解乳蛋白（LH）、水解核酸（RH）、酵母提取物（YE）、和穀氨酰胺等。例如500mg/L的LH，對小麥花粉的愈傷組織的形成和分化成苗有一定的效果。
⑤活性碳的作用在培養基中加入活性碳，也有促進花粉中愈傷組織和胚狀體形成作用。例如1%的活性碳，使煙草花藥出苗率提高1～4倍。0.5%的活性碳，使玉米花藥中愈傷組織或胚狀體的誘導頻率提高一倍左右，在分化培養基中加入0.5%的活性碳，還能促進分化苗的健壯，根係發達。活性碳產生的這些良好效果的原因還不太清楚，可能是由於活性碳吸附了培養物在培養過程中分泌的有毒代謝產物，或吸收了蔗糖在高壓消毒時產生的有毒化合物——5-羥甲基糠醛，從而給花粉細胞的分裂、分化和幼苗的生長，創造了有利的條件的緣故。
⑥培養基中pH值對培養效果的影響在曼陀羅的花藥培養中觀察到隨著pH值的變化，產生胚狀體的花藥百分率增加，當pH值達到5.8時，效果最好。pH值達到6.5時，花粉不形成胚狀體，經鏡檢，未看到花粉發生細胞分裂。
⑦條件培養基的作用所謂的條件培養基是指植物組織培養物可分泌某些物質進入培養基，使得培養基條件化，成為條件培養基（conditionedmedium）。經過條件化的培養基可以促使培養物細胞的分裂和生長。這種培養基最近被用來培養大麥的花藥，得到了極好的效果。據許智宏等報道，先將雙核早期大麥的花藥接種到馬鈴薯和N6培養基上（含1.5mg/L的2,4-D和0.5mg/L的激動素）,接種密度為每毫升培養液為10～20個花藥，培養7天後，取出花藥並通過離心去掉散落的花粉和細胞碎片，得到條件化的培養基。然後將單核中期的花藥接種到條件培養基上，著在這種培養基上80～90%的大麥花藥形成愈傷組織，而對照的液體培養基上隻有大約5%的花藥有反應。他們還指出，除了本種植物外，異種花藥也能使培養基條件化。甚至子房組織也能使培養基條件化，這一結果揭示植物組織在培養過程中分泌出某些對細胞分裂和生長普遍起作用的物質。