（三）點樣樣品
點樣樣品的製備是非常關鍵的一步。樣品的純度、雜交特異性直接決定自製芯片的質量和可信度。
Clontech公司的Atlas中，Glass Array和Plastic Array上那8300個基因對應的80堿基長寡核苷酸序列是經過Clontech公司專利軟件在GenBank中篩選出的同源性最低，又經Clontech實驗確保能給出很強雜交信號的片段。這種精巧的設計保證很高的分辨率、靈敏度。可以通過基因公司訂購這些寡核苷酸來製作自己的芯片。足夠點1000次芯片的8327個人類基因、5002個小鼠基因或者將近4000個大鼠基因的寡核苷酸片段（凍幹）放在96孔板中，連同100個Type Ⅱ玻片和雜交盒，200mL雜交液，全麵滿足中小型實驗項目的需求。這些寡核苷酸序列數目齊全，質量可靠，能為自製芯片的靈敏度和分辨率提供可靠的保證，也避免了合成8000多基因的麻煩。
在Yeast Genome Oligo Set提供斯坦福大學酵母基因組數據庫（SGD）裏，從6307個釀酒酵母的開放閱讀框中，挑選長度為70-mer單鏈寡核苷酸和10個對照，所有的序列經過BLAST保證同源性最低，避免非特異雜交。每種Oligo有2000pmol，足夠點2000～6000張片。
對於較大規模製作芯片的用戶，由於點樣樣品數目太多，即使采用高通量試劑盒還是不夠方便。這時不妨考慮分子生物學的標準工作站——全自動核酸和蛋白純化工作站。這可不同於那種單一樣品大量純化的係統，而是特別適合芯片製作的很多個樣品小量純化係統。
（四）芯片雜交
當兩個不同來源的單鏈DNA分子（DNA片段）核苷酸序列互補時，在複性條件下，可以通過堿基互補配對成為雙鏈“雜種” DNA分子（DNA片段），此過程稱為DNA雜交。如果其中一個單鏈DNA分子(DNA片段)帶有容易檢測的標記物(DNAI探針)，經雜交後就可以檢測到另一個單鏈DNA分子(DNA片段)。轉化子的總DNA，經過變性處理成為單鏈DNA分子(DNA片段)，用預先根據待檢測的重組DNA分子製備的DNA探針與其雜交，進一步根據標記物檢測雜交的DNA片段，出現陽性雜交的轉化子就是預期的重組子。雜交的方法有Southern印跡雜交、斑點印跡雜交和菌落(或噬菌斑)原位雜交等。
Southern印跡雜交是先從轉化子中提取總DNA，經限製性內切核酸酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分帶，轉移到用於雜交的膜上，變性處理後再用DNA探針與其雜交。斑點印跡雜交是把提取的轉化子總DNA直接點樣到用於雜交的膜上，變性處理後再用DNA探針與其雜交。菌落(或噬菌斑)原位雜交是直接把菌落或噬菌斑印跡轉移到用於雜交的膜上，經溶菌和變性處理後使DNA暴露出來並與濾膜原位結合，再用DNA探針與其雜交。用Southern印跡雜交法不僅可以鑒定重組子中含有重組DNA分子，而且還可以知道待檢測的DNA分子(DNA片段)大小以及待檢測的DNA片段在重組DNA分子中的位置，但是此方法操作比較麻煩。後兩種方法操作比較簡單，但是隻能區別是否含有待檢測重組DNA分子的重組子。菌落(或噬菌斑)原位雜交已廣泛地用於從基因組DNA文庫和cDNA文庫中篩選含目的基因的重組子。
DNA雜交探針是指帶有某種標記物的特異性核苷酸序列，能與該核苷酸序列互補的DNA進行退火雜交，並且可以根據標記物的性質進行有效的檢測。早期用得較多的是32P等放射性物標記的DNA雜交探針，其具有高放射性，可用放射自顯影檢測，靈敏度高，但安全性低，32P標記的核苷酸半衰期短(14.3d)，探針不能長期保存。目前已廣泛使用生物素、地高辛或熒光素等非放射性物標記的DNA雜交探針，它們可以根據各自的生物化學性質或光學特性進行檢測。雖然靈敏度略低於放射性標記，但是安全、保存期長。
不論對ONA（片上就位合成寡核苷酸點陣芯片）或CDA（用微量點樣技術製作cDNA點陣芯片）來說都是芯片檢測的關鍵一步，在此步中發生靶標樣品核酸與探針之間的選擇性反應。反應雙方中總有一方固定在芯片上，而另一方則在標記後通過流路或加樣至芯片上，芯片雜交中固定在芯片上的，往往是成千上萬的探針，而與之雜交的是經過標記(同位素或熒光)的樣品核酸，此靶標樣品核酸往往需先經過PCR擴增或克隆或逆轉錄(mRNA)，然後打碎成文庫。同位素或熒光標記則在擴增或逆轉錄過程中進行。標記的靶標與固定探針在經過試驗確定的嚴謹條件下進行分子雜交。芯片雜交屬於固-液相雜交，與膜上雜交相似。互補雜交要根據探針的類型、長度以及研究目的來選擇優化雜交條件。如用於基因表達檢測，雜交時需要高鹽濃度、樣品濃度高、低溫和長時間(往往要求過夜)，但嚴謹性要求則比較低，這有利於增加檢測的特異性和低拷貝基因檢測的靈敏度；若用於突變檢測，要鑒別出單堿基錯配，需要在短時間內(幾小時)、低鹽、高溫條件下高嚴謹性雜交。多態性分析或者基因測序時，每個核苷酸或突變位都必須檢測出來，通常設計出一套四種寡聚核酸，在靶序列上跨越每個位點，隻在中央位點堿基有所不同，根據每套探針在某一特點位點的雜交嚴謹程度，即可測定出該堿基的種類。
當雜交混合物中靶標濃度約10倍於互補分子時，出現假一級反應動力學。此時，雜交速率主要決定於探針濃度，探針濃度提高1倍，信號也增強1倍。假一級反應在結果定量中，大大有利於減輕製作點陣芯片中各單元點因靶標濃度不準確所導致的微小差異。這一點對於平行分析尤其重要。
當靶標濃度等於或低於探針濃度時則出現二級反應動力學。此時固定DNA(靶標)濃度的微小差異，將對雜交速率和信號絕對值產生較大的影響。目前合成技術能製造出高濃度的靶標芯片，所以可以在較寬的樣品濃度中呈現出假一級動力學。大部分已發表的ONA和CDA分析的論文中應用的芯片都含有過剩的固定化靶標DNA。
一價陽離子如Na+的存在可以提高異源雜交雙鏈生成的速度。其原理是Na+可掩蔽帶負電磷酸根骨架，後者可影響靶標與探針分子間堿基配對的互相作用。通常在ONA和CDA芯片雜交時應用的Na+濃度為1mol/L。肽核酸探針的雜交幾乎不受鹽濃度的影響。倘若雜交溫度顯著地低於異源雜交物的熔點時，溫度對雜交速率有正效應。一般，ONA和CDA試驗中雜交溫度分別為25～42℃及55～70℃。最佳的鹽濃度和雜交溫度需通過試驗來判定。
序列組成是最不能控製的參數，而對ONA的影響要大於CDA。G∶C間形成三個氫鍵，而A∶T間形成二個氫鍵，所以富GC區雜交雙鏈的穩定性較好。當這些穩定區長度達到約50個堿基時，可以產生“成核”區，異源雙鏈由此延伸。考慮到在1次芯片雜交中將會形成成千上萬個異源雜交物，所以有必要選擇出一個最協調的雜交條件，使信噪比對盡可能多的異源雙鏈為最佳。這一條件可引入適當的陽性和陰性對照序列加至芯片，也可以在一些陽性對照中用添加法試驗出來。
ONA的雜交物理化學顯然與CDA不同，ONA雜交受CC含量影響明顯大於較長的DNA序列。為了減少這一影響，可以在雜交混合液中加入一些能平衡AT及GC雜交結合能的試劑，如四甲基氯化銨(TMAC)。而在0.5～2.0kb的CDA序列中，堿基比例的影響要小得多，所以不必用TMAC。這一因素在用ONA芯片的再測序和診斷中需要研究。
雜交後的芯片要經過嚴謹條件下的洗滌，洗滌除去未雜交的一切殘留物。這一步驟也需要包括在雜交流路中。已經商品化的雜交室有Affymetrix的Genechip Fluiditics，Telchem公司的ArraylTTM，Hybn-dizationCassette，Nanogen公司的芯片卡套。
總的來說，雜交特異性和交叉雜交是重要而複雜的，不論在ONA或CDA芯片的應用中都要認真考慮。
CDA操作程序：取得目的基因模板，用PCR擴增。經純化和質控後取5rtl，用微機控製的高速機械手將其印點於塗層載玻片上。測試和參比樣品所得的總RNA分別用Cy-3及Cy-5-duTP於反轉錄時引入標記，熒光標記靶標混合後在嚴謹條件下與芯片上克隆陣列雜交。芯片上雜交固定的熒光靶標用激光光源激發，發射出特定波長的熒光用激光共聚焦顯微鏡掃描，所得單色圖像輸入軟件。測得各點上靶標的信息包括：基因名稱、克隆鑒定、強度和比例、歸一化參數和可信限。一次雜交試驗的數據用歸一化(Cy3∶Cy5)表示：比例為1表示測試與參比樣品基因表達水平無變化，比例>1表示增高，比例