法國生物梅裏埃公司的GEN-PROBE係統,采用雜交保護分析法(HPA)研製成金黃色葡萄球菌檢驗和鑒定試劑盒,已成功應用於檢測食品中的金黃色葡萄球菌。其主要原理是:檢測菌的細胞經溶解後,釋放出目標rRNA。目標rRNA在60℃與標記物(acridinium ester,AE)探針雜交,形成有標記物的雜交DNA。在選擇性試劑的作用下,遊離探針的化學發光標記物溶化,雜交DNA的化學發光標記物受到保護。加入檢測試劑(H2O2OH-),化學發光分子被氧化水化發出強光。用發光計量儀檢測光強度。
三、李斯特氏菌
應用DNA探針技術檢測李斯特氏菌或單增李斯特氏菌的試劑盒目前有:生物梅裏埃公司的“Accuprobe Listeria monocytogenes”和GENE-TRAK的“GENE-TRAK Listeria”。梅裏埃公司的GenProb在李斯特氏菌的檢測中,用於單增李斯特氏菌的鑒定。目前這一方法也正在申請AOAC認可。
該法用特異的DNA探針進行李斯特氏菌核糖體RNA(rRNA)的檢測,待檢樣品經前增菌和二次增菌後溶解細菌,加入標記好的李斯特氏菌特異性的DNA探針用於液相雜交。如果待檢樣品中存有李斯特氏菌rRNA,熒光素標記的檢測探針和多聚脫氧腺嘌呤核苷酸(poly dA)末端捕獲探針將與目標rRNA序列進行雜交。然後把包被有多聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(poly dT)的塑料測杆(固相)插入雜交溶液。poly dA和poly dT之間進行堿基配對,便於探針的捕獲:目標雜種核酸分子結合在固體載體上,未結合的探針被衝洗掉。測杆被培養在辣根過氧化物酶-抗熒光素接合劑中,接合劑與存在於雜交檢測探針上熒光素標記物結合,未結合的接合劑被衝洗掉。並將測杆培養於酶底物-色原溶液中。辣根過氧化物酶與酶底物反應,將色原轉變為藍色化合物。一旦遇酸反應便停止,色原的顏色變為黃色。在450nm處測量吸收值,吸收值大於臨界值則表明在檢測的樣品中存有李斯特氏菌。
四、存在的問題及展望
核酸探針技術雖為一種快速、敏感、特異的檢測新技術,但其在實際應用中仍存在不少問題。放射性同位素標記的核酸探針具有半衰期短、對人體有危害等缺點,作為常規診斷,特別是在食品檢驗實驗室很不適用。生物素標記的核酸探針雖然對人畜無害,但其不足之處在於受紫外線照射易分解。另外,臨床標本(如食品)中的內源性生物素化蛋白質和其他糖蛋白類物質常引起背景加深和非特異性反應。同時,菌落雜交的敏感性也受其他因素的影響。但是我們相信,隨著該技術的發展與完善,其在食品微生物檢驗中將會成為一種有效的檢測技術。