探針是同被吸印的DNA序列互補的RNA或單鏈DNA,一旦同濾膜上的單鏈DNA雜交之後,就很難再解鏈。因此可以用漂洗法去掉遊離的沒有雜交上的探針分子。用X光底片曝光後所得的放射自顯影圖片,同溴化乙錠染色的凝膠譜帶作對照比較,便可鑒定出究竟哪一條限製性片段是同探針的核苷酸序列同源的。Southern DNA印跡雜交方法十分靈敏,在理想的條件下,應用放射性同位素標記的特異探針和放射自顯影技術,即使每條電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。它幾乎可以同時用於構建出DNA的酶切圖譜和遺傳圖,因此在分子生物學及基因克隆實驗中的應用極其廣泛。
(二)Northern印跡雜交
Northern印跡雜交的基本原理與Sorthern印跡雜交基本相同,不同之處在於:
(1)RNA在進行凝膠電泳之前需經變性處理,在電泳過程中保持變性狀態;而DNA在電泳前和電泳過程中均未變性;
(2)電泳結束後,凝膠中的RNA不經任何處理,可直接將其轉移到硝酸纖維素濾膜上;而DNA在轉移前需經堿變性及中和處理;
(3)RNA-DNA雜交不如DNA-DNA雜交那麼強,用於RNA-DNA的雜交液中含有較多的成分,以促進RNA-DNA結合;雜交後,洗脫條件也不像DNA-DNA雜交那樣強烈;
(4)在DNA凝膠電泳中,用標準DNA參照物確定樣品DNA的大小,而在總RNA中,則含有28S rRNA和18S rRNA,其含量遠遠高於其他RNA,因此可將這二者形成的條帶作為參照物,在雜交後確定目的mRNA的大小,並可顯示RNA是否在製備過程中已降解。
故該法用於檢測mRNA。早期由於RNA分子不能同硝酸纖維素濾膜結合,所以Southern印跡技術不能直接地應用於RNA的吸印轉移。1979年,J.C.Alwine等人發展了一種方法,其基本步驟是將電泳凝膠中的RNA轉移到疊氮化的或其他化學修飾的活性濾紙上,通過共價交聯使用而使它們永久地結合在一起。此法由於與Southern DNA印跡雜交技術十分相似,故稱為Northern印跡雜交技術(Northern blotting)。
(三)斑點印跡雜交和狹線印跡雜交
斑點印跡雜交(Dot blotting)和狹線印跡雜交(Slot blotting),是在Southern印跡雜交的基礎上發展的兩種類似的快速檢測特異核酸(DNA或RNA)分子的核酸雜交技術。它們的基本原理和操作步驟是相同的,都是通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品,直接轉移到適當的雜交濾膜上,然後再按如同Southern或Northern印跡雜交一樣的方式同核酸探針分子進行雜交。由於在實驗的加樣過程中,使用了特殊設計的加樣裝置,使眾多待測的核酸樣品能夠一次同步轉移到雜交濾膜上,並有規律地排列成點陣或線陣,因此人們通常又稱此兩種核酸雜交方法分別為斑點印跡雜交和狹線印跡雜交。
(四)原位雜交
1975年,M.Grunstein和D.Hogness根據檢測重組體DNA分子的核酸雜交技術原理,對Southern印跡技術作了一些修改,發展出了一種菌落雜交技術。之後在1977年,W.D.Benton和R.W.Davis又發展了與此類似的篩選含有克隆DNA噬菌斑的雜交技術。這類技術是把菌落或噬菌斑轉移到硝酸纖維素濾膜上,使溶菌變性的DNA同濾膜原位結合。這些帶有DNA印跡的濾膜烤幹後,再與放射性同位素標記的特異性DNA或RNA探針雜交。漂洗除去未雜交的探針,同X光底片一道曝光。根據放射自顯影所揭示的同探針序列具有同源性DNA的印跡位置,對照原來的平板,便可以從中挑選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。
菌落雜交或噬菌斑雜交有時也稱原位雜交(In situ hybridization),因為生長在培養基平板上的菌落或噬菌斑,是按照其原來的位置不變地轉移到濾膜上,並在原位發生溶菌、DNA變性和雜交作用。要從成千上萬大量的菌落或噬菌斑組成的真核基因組克隆庫中,鑒定出含有期望的重組體分子菌落或噬菌斑,菌落原位雜交技術有著特殊的應用價值。這樣的實驗中往往要檢測大量的菌落或噬菌斑,可以想象其工作量是相當大的。