4.cDNA探針的標記
來源於鳥類髓母細胞病毒(AMV)的反轉錄酶，是一種依賴於RNA的DNA聚合酶，具有多種酶促活性，包括5′→3′DNA聚合酶活性及RNADNA雜交體特異的RNase H酶活性。此酶主要應用於將mRNA反轉錄成cDNA而應用於cDNA克隆，亦可用於RNA或單鏈DNA模板的32P標記探針的製備。當以poly(A)mRNA為模板時，反轉錄酶的引物可以是oligo—dT，也可采用特異的寡核苷酸引物，還可采用隨機寡核苷酸作為引物。反轉錄得到的產物RNADNA雜交雙鏈經堿變性後，RNA單鏈可被迅速降解成小片段，經Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈DNA探針。
5.寡核苷酸探針的標記
人工合成的寡核苷酸片段作為分子雜交的探針，已日益為更多的研究者所青睞。利用寡核苷酸探針，可以檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。多種酶促反應可用於寡核苷酸探針的末端標記，如T4多核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶、末端脫氧核苷酰轉移酶等。
（1）T4多核苷酸激酶標記法T4多核苷酸激酶的作用是催化ATP分子上的γ-磷酸基團轉移到DNA或RNA分子的5′-OH基團上。因此，采用γ-32p-ATP為底物，即可將寡核苷酸5′末端標記。該法的缺點是在每個探針的5′末端多加了一個磷酸，理論上，這會影響其與DNA的雜交，因此，有人建議使用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸法獲得高放射活性的寡核苷酸探針。
（2）Klenow DNA聚合酶標記法對於帶黏性末端的雙鏈寡核苷酸，可利用Klenow DNA聚合酶的填充反應進行末端標記；而對於單鏈寡核苷酸，則可預先合成一小段(如8-mer)與此探針互補的寡核苷酸作為引物，然後利用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸反應獲得標記的寡核苷酸探針。此法的特點是模板DNA與標記的DNA探針的長度不相同，因此可采用電泳方法將它們分離開來。
（3）末端脫氧核苷酰轉移酶標記法末端脫氧核苷酰轉移酶能催化dNTP在單鏈DNA3′末端的多聚化。在Co2+替代正常輔助因子Mg2+的情況下，也可利用雙鏈DNA作為底物。
（二）探針的非放射性標記法
非放射性標記物主要有兩種類型：一類是預先已連接在NTP或dNTP上，因此可像放射性核素標記的核苷酸一樣，用酶促聚合方法摻入到核酸探針上，如生物素、地高辛（DIG）等；另一類是直接與核酸進行化學反應而連接在核酸上。這裏重點介紹非放射性DIG（地高辛）標記方法。
1.PCR標記法
在PCR反應中，熱穩定聚合酶（如Taq聚合酶）能數以百萬倍地快速擴增靶DNA，聚合酶以DNA為模板催化dNTP的聚合反應，其中摻入適宜比例的DIG-dUTP，擴增的DNA片段即被DIG標記，敏感性和特異性都很高，PCR標記反應的特異性使得這種技術特別適合於合成短序列的探針。PCR標記的探針特別適合於在基因組Southern印跡中檢測單拷貝基因序列和Northern印跡中稀有mRNA的檢測。當然，也適合於文庫篩選、斑點狹縫印跡和原位雜交。
PCR標記法（PCR Labeling）可以從非常少量的模板產生大量的標記探針，模板的量從10～100pg，質粒或1～50ng基因組DNA均可。然而，就經驗而言，10pg質粒或10ng基因組DNA產生的結果最佳，克隆質粒的插入序列比基因組DNA會產生更好的結果。PCR引物序列的特異性決定了哪一區域被擴增和標記。模板的質量一般不影響PCR標記反應，甚至煮沸法獲得的質粒也可用作模板，也意味著比其他標記方法，反應條件更需要優化。當模板數量非常有限，或模板不是很純，或模板很短時，首選PCR法製備DIG標記探針。
2.體外轉錄標記RNA探針
體外轉錄標記RNA探針（RNA labeling）是在體外由DNA模板轉錄產生。DNA片段被插入到載體的多克隆位點中，在其兩邊有不同的RNA聚合酶啟動子（例如，T7，SP6、T3RNA聚合酶），反應前模板需要線性化（在插入序列附近），在RNA聚合酶作用下則插入的DNA序列轉錄成互補RNA序列，反應中加入DIG-dUTP，模板DNA可被轉錄許多次（可達100倍之多），產生出大量的全長的DIG標記的RNA探針（在標準反應中，1μg DNA可產生10~20μg RNA），大約每25~30中核苷酸可摻入一個DIG標記的UTP。
特異性模板序列位於啟動子（例如T7，SP6，或T3 RNA聚合酶）的下遊。模板可以是高度純化的線性化質粒DNA或有啟動子序列的PCR產物。標記的RNA探針非常敏感，事實上，對於檢測RNA標本而言，DIG標記的RNA探針比DIG標記的DNA探針更敏感。所以，RNA探針特別適合於Northern印跡中稀有mRNA的檢測，也適用於Southern印跡、文庫篩選、斑點狹縫印跡和原位雜交。
比較而言，產生DIG標記DNA探針最靈活和強有力的方法是PCR的方法，特別是得不到高純度的模板時。如果能得到高純度的模板，則隨機引物標記法也能產生出同樣敏感的探針。DIG標記的RNA探針在檢測RNA靶基因時最敏感。
三、探針的純化
DNA探針標記反應結束後，反應液中仍存在未摻入到DNA中去的dNTP等小分子，需純化將之去除，否則會幹擾下一步反應。探針純化方法分述如下。
（一）凝膠過濾柱層析法
利用凝膠的分子篩作用，將大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸(