（5）引物之間兩引物間不應有互補性，尤應避免3′端重疊，這樣可避免形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。引物間的連續互補不應超過4個堿基。
（6）引物的3′端引物的延伸是從3′末端開始的，3′末端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，嚴格要求配對。實驗表明，引物的3′末端末位堿基在錯誤配對時，不同堿基的引發效率存在很大差異，當末位堿基為T時，即使在錯配的情況下，也能引發鏈的合成，而末位堿基為A時，錯配時引發效率最低，G、C居於中間，所以3′末端末位堿基最好選A、G、C，而不選T，尤其避免出現連續2個以上的T。
（7）引物的5′端引物5′末端對擴增的特異性影響不大，隻要與DNA結合的長度足夠即可，因此5′末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈遊離狀態。在引物設計時可在5′末端加上限製性內切酶位點、進行標記、引物DNA結合蛋白序列、引入突變位點、插入與缺失突變序列、引入一些啟動子序列，以及一些特殊目的序列等。如有可能，酶切位點最好加在引物的中間。
（8）避開簡並位點如擴增編碼區域，不要使引物3′端終止於密碼子的第三位，因該位置易發生簡並，而影響擴增的特異性與效率。
（9）引物的特異性引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70％或有連續8個互補堿基。而引物要與特異性擴增序列有較高的同源性。選自靶DNA序列兩端保守區，可設計出不同特異性的引物，如檢測病原微生物，可選擇出針對屬、種、型的共同抗原基因保守區的引物。應查出親緣關係密切的微生物相關基因進行比較，以免交叉擴增。為保證引物擴增的特異性，應在待分析基因組中的高度保守區內設計引物。另外，有的病原體不同的保守區域內，引物的擴增敏感度不同，應加以注意。
（10）擴增片段的長度在臨床檢測中擴增片段長度一般在100~800bp間，多在200~600bp間，以利於循環參數的統一及擴增產物分析。
三、引物合成的質量
引物序列確定之後，由專門實驗室和專門的技術人員用核苷酸合成儀合成引物。合成的引物必須經聚丙烯酰胺凝膠法、離子交換法、高效液相色譜法(HPLC)、寡聚核苷酸純化柱法或反向HPLC純化。否則，合成的引物中含有相當數量的“錯誤序列”，其中包括不完整的序列和脫嘌呤產物，以及可檢測到的堿基修飾的完整鏈和高分子質量產物。這些序列可導致非特異擴增和信號強度降低，因此PCR中所用引物質量要高，而且要純化、定量。