一、紫外-可見吸收光圖譜每一波長的入射光通過樣品溶液後都可以測得一個吸光度值A。以波長作橫坐標，以相應的吸光度A作縱坐標作圖，便可得到一個吸收光譜圖。現在很多儀器可以直接給出樣品溶液在全波長或選定波長範圍內的掃描圖譜。
吸收光譜又稱吸收曲線。吸收光譜的特征：曲線1處的峰稱為最大吸收峰，它所對應的波長稱為最大吸收波長(λ最大)，在峰旁邊有一個小的曲折(3處)稱為肩峰，很多物質是沒有肩峰的；曲線2處的峰穀所對應的波長為最小吸收波長(λmin)；5處為第二吸收峰；在吸收曲線波長最短的一端，吸收相當強而不成峰形的部分(4處)，稱為末端吸收。一個物質在吸收光譜上，因為特殊的分子結構，有些物質會出現幾個吸收峰，在λmax處是電子能階躍遷時所吸收的特征波長，不同物質有不同的最大吸收峰，有些物質則沒有吸收峰。光譜上的λmax、λmin、肩峰以及整個吸收光譜的形狀，決定於物質的性質，其特征隨物質結構而異，所以它是物質定性的依據。
二、光度測量條件的選擇
(一)入射光波長的選擇
進行樣品溶液定量分析時，關鍵問題是如何選擇適宜的檢測波長。將樣品溶於適宜的溶劑中，配成適宜濃度，在紫外-可見分光光度計上進行掃描，得紫外-可見吸收光譜曲線。通常應選被測物質吸收光譜中吸收峰處的波長作為測定波長，以提高靈敏度並減少測定誤差。被測物如有幾個吸收峰，可選不易有其他物質幹擾的、較高（百分吸收係數較大）的和寬的吸收峰波長進行測定。例如核黃素在200～600nm有四個吸收峰。它在265nm處吸收強度最大，但它偏向短波長區，易受樣品溶液中雜質幹擾，另一方麵由於在265nm吸收峰的上下坡處吸光度隨波長的變化而變化很大，故不宜選作檢測波長，因而常選擇444nm波長進行定量分析，雖然其靈敏度差些，但雜質幹擾少。
另外，對於雙波長或多波長分光光度法中測定波長的選擇，見下文“計算分光光度法的簡介”。
(二)溶劑的選擇及處理方法
溶劑的性質對溶質的吸收光譜的波長和吸收係數都有影響。極性溶劑的吸收曲線較穩定，且價格便宜，故在分析中，常用水（或一定濃度的酸、堿及緩衝液）和醇等極性溶劑作為測定溶劑，但水、醇等極性溶劑會引起吸收峰位置及寬度的改變，使用時應當注意這一點。測定樣品吸光度的溶劑應能完全溶解樣品，且在所用的波長範圍內有較好的透光性，即不吸收光或吸收很弱。許多溶劑在紫外區有吸收峰，隻能在其吸收較弱的波段使用，當所采用的波長低於溶劑的極限波長時，則應考慮采用其他溶劑或改變測定波長。
分光光度法要求“光譜純”溶劑或經檢驗其空白符合規定者方能使用。烴類溶劑可以通過矽膠或氧化鋁吸附，或用化學方法處理以除去雜質。現將幾種主要溶劑的處理或注意事項簡述如下。
（1）蒸餾水蒸餾水在210～700nm波長範圍內無吸收，故應用範圍很廣，其局限性是大多數有機化合物不溶於水。在應用前，混懸於水中的微小氣泡必須事先煮沸除去，否則因氣泡引起的散射光將引起誤差。
（2）乙醇精製乙醇的極限吸收波長為215nm。乙醇中常會有醛類雜質（其吸收峰約在290nm），可先加1％的氫氧化鈉及少量硝酸銀，回流1h後再行蒸餾。95％乙醇為常用溶劑，市售無水乙醇常含有微量苯，其在紫外區有吸收，使用時需予以注意。
（3）環己烷和正己烷其吸收波長在220nm以下，通常含有苯。除去苯的方法是加10％的濃硫酸和1％發煙硝酸，振蕩並放置24h後，用稀氫氧化鈉溶液和高錳酸鉀溶液依次洗滌。再用氯化鈣幹燥，蒸餾即得。
（4）氯仿許多不溶於乙醇的物質能溶於氯仿，氯仿的波長極限為245nm，氯仿容易被光和空氣破壞，添加1％乙醇可予以防止。使用前加硫酸振蕩，用水洗滌，再用氯化鈣幹燥後，蒸餾即得。
（5）乙醚乙醚的應用範圍很廣，對有機化合物溶解度大為其優點，揮發性大，測量須在封閉條件下進行，操作不便是其缺點。使用前應除去其中的過氧化物。
(三)參比溶液的選擇
參比溶液又稱空白溶液。在分光光度測定中，常使用參比溶液，其作用不僅是調節儀器的零點，還可以消除由於比色杯、溶劑、試劑、樣品基底和其他組分對於入射光的反射和吸收所帶來的影響。因此，正確選用參比溶液，對提高分析的正確性有重要的作用。選擇參比溶液的一般原則如下。
(1)如果試液和顯色劑均無色，可用蒸餾水作參比溶液。
(2)如果顯色劑或其他試劑是有色的，應選用試劑（不加試液）作參比溶液。
(3)如果顯色劑為無色，而被測試液中存在其他有色離子，可采用不加顯色劑的被測試液作參比溶液。
(4)如果顯色劑和被測試液均有顏色，則應采用褪色參比。即在一份試液中，加入適當的掩蔽劑，以掩蔽被測組分，使它不再與顯色劑作用，而顯色劑及其試劑均仍按試液測定方法加入作為參比溶液來消除幹擾。例如，鉻天青S比色測定鋼樣中Al3+時，Ni2+、Co2+等有色離子及過量鉻天青S（藍色）均對測定有幹擾。按上述方法，在被測試液中加入適量F-，以生成無色的(AlF6)3-，然後按操作方法加顯色劑和其他試劑，以此溶液為參比，便可抵消Ni2+、Co2+等對入射光的吸收，也消除了顯色劑本身顏色的幹擾。
(四)吸光度讀數範圍的選擇
光度分析的誤差來源有兩個方麵：首先是分光光度計本身的誤差，即光度誤差；其次是由各種化學因素引入的誤差(如顯色劑的選擇、幹擾離子的影響等)。光度誤差主要來源於光源、檢測器和讀數顯示係統的測量誤差總和，並最後表現在儀器透光度標尺上的讀數誤差ΔT。光度計的讀數誤差必然會導致一定程度的濃度測定相對誤差。那麼，光度計的讀數應在什麼範圍內才能使濃度測定的相對誤差最小呢?
假定光度計讀數誤差ΔT=1%，而又要求溶液質量分數測量的相對誤差不大於4%，則被測試液的透光率需選在70%～15%，即吸光度需落在0.16～0.80範圍內。在實際工作中常常是改變被測液的濃度，以使吸光度A在上述讀數範圍內，也可以通過改變比色杯的厚度或改變入射光的波長，使吸光度A落在上述讀數範圍內。
三、定性分析
紫外-可見光吸收光譜可提供化合物的某些能吸收紫外-可見光的基團（大多是共軛的不飽和基團或含有芳香結構）的信息。紫外-可見分光光度法用於定性一般是根據吸收光譜、λmax和ε三者的一致性。由於所用單色光的純度、樣品的純度、儀器的準確度、所采用的溶劑以及溶液的酸堿性等條件對吸收光譜的形狀與數據都會產生影響，所以用分光光度法作定性分析時，要求儀器的準確度高、單色光性能好，試樣的純度要求經過多次重結晶，幾乎無雜質，熔點敏銳，熔距短，另外還要求采用規定的溶液條件，這樣所獲得的結果才能可靠。
但紫外-可見光譜在定性檢測方麵有一定的局限性，所能提供的定性信息不如紅外吸收光譜優越。盡管相同的化合物在同一條件下測得的吸收光譜應相同，但吸收光譜相同不一定為同一化合物。這是由於紫外-可見光譜曲線吸收帶不多，常常隻含2～3個較寬的吸收帶，光譜的形狀變化不大，在成千上萬種有機化合物中，若分子中發色團相同，而其他部分結構略有不同，則它們的紫外-可見吸收光譜常常十分相似。所以在得到相同的相似光譜時，應考慮到有並非同一物質的可能性。為了進一步確證，有時可換一種溶劑或采用不同酸堿性的溶劑，再分別將標準品和樣品配成溶液，測定光譜圖作比較。與紅外吸收光譜、質譜、核磁共振譜一起，用以解析物質的分子結構。用紫外-可見分光光度法對化合物進行定性分析時，一般采用與標準品、標準譜圖對照、對比吸收光譜特征數據及對比吸收度的比值三種方法。
（1）與標準品、標準譜圖對比將樣品和標準品以相同濃度配製在相同溶劑中，在同一條件下分別測定吸收光譜，比較光譜圖是否一致。若二者是同一物質，則二者的光譜圖應完全一致。如果沒有標準品，也可以和標準圖譜（如Sadtler標準圖譜）對照，但這種方法要求儀器準確度、精密度高，而且測定條件要與標準圖譜的要求相同。
（2）對比吸收光譜特征數據最常用於鑒別的光譜特征數據有吸收峰的波長λmax和峰值處吸收係數εmax、E1%1cm。對於具有不止一個吸收峰的化合物，也可同時用幾個峰值作為鑒別依據。肩峰或吸收穀處的吸收度測定受波長變動的影響較小，有時也用穀值或肩峰值與峰值同時用作鑒別數據。
（3）對比吸收度的比值有些化合物的吸收峰較多，如核黃素有四個吸收峰（220nm、265nm、372nm、444nm），就可采用在其中2～4個吸收峰處測定吸收度，求出這些吸收度的比值，規定吸收度在某一範圍，作為鑒別化合物的依據之一。
四、定量分析
紫外-可見分光光度法適宜測定微量物質的含量，如果物質的E1%1cm在300以上(即相當於濃度為10μg/mL的該溶液的吸光度Aλmax在0.3以上)，就可以進行定量測定。本法具有準確、靈敏、簡便和具有一定的選擇性等優點，故在定量分析中是應用比較廣泛的一種分析方法。
(一)紫外分光光度法定量分析
采用紫外分光光度法進行定量分析時，除另有規定外，應以配製樣品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度，以核對樣品的吸收峰波長位置是否正確。除另有規定外，吸收峰波長應在樣品規定波長±1nm以內，並以吸光度最大的波長作為測定波長。狹縫寬度的選擇，應以減少狹縫寬度時樣品的吸光度不再增加為準，或調節狹縫由小到大，直到樣品吸光度不變為止。用於含量測定的方法一般有以下幾種。