1.流動相的選擇
選擇好一定的填料後，強溶劑使溶質在填料表麵的吸附減少，相對應的容量因子（k′）降低；而較弱的溶劑使溶質在填料表麵吸附增大，相應的容量因子升高。因此，k′值是流動相組成的函數。塔板數N一般與選擇的流動相的黏度成反比。所以流動相的選擇應考慮：①流動相應不改變填料的任何性質；②流動相純度要高；③流動相與檢測器匹配；④流動相黏度要低；⑤溶解度要理想；⑥樣品容易回收。
在選用流動相時，溶劑的極性仍為重要的依據。例如在正相液-液色譜中，可先選中等極性的溶劑為流動相，若組分的保留時間太短，表示溶劑的極性太大。接著可選用極性較弱的溶劑，若組分保留時間太長，則表明溶劑的極性又太小，說明合適的溶劑其極性應在上述兩種溶劑之間。如此多次實驗，以選得最適宜的溶劑。
常用溶劑的極性順序排列如下：
水（極性最大）、甲酰胺、乙腈、甲醇、丙醇、丙酮、二氧六環、四氫呋喃、甲乙酮、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、異丙醚、二氯甲烷、氯仿、溴乙烷、苯、氯丙烷、甲苯、四氯化碳、二硫化碳、環乙烷、乙烷、庚烷、煤油（極性最小）。
為了獲得合適的溶劑強度（極性），常采用二元或多元組合的溶劑係統作為流動相。通常根據所起的作用，采用的溶劑可分成底劑及洗脫劑兩種。底劑決定基本的色譜分離情況；洗脫劑則起調節試樣組分的滯留並對某幾個組分具有選擇性的分離作用。因此，流動相中底劑和洗脫劑的組合選擇直接影響分離效率。正相色譜中，底劑采用極性溶劑如正己烷、苯、氯仿等，而洗脫劑可根據試樣的性質選擇極性較強的針對性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。在反相色譜中，通常以水為流動相的主體，以加入不同配比的有機溶劑作調節劑。常用的有機溶劑是甲醇、乙腈、二氧六環、四氫呋喃等。
2.液相色譜常用的流動相
一般根據色譜分離條件選擇流動相的強度，液-固色譜通常是在極性吸附劑上選用非極性(如己烷)以及極性(如醇)溶劑作為流動相運行，為了減輕由於保留時間增長產生峰形拖尾、柱效和線性容量降低的現象，通常加入一定量的水控製吸附劑的活性，所需的水常常加到流動相或吸附劑中，水的量對非極性流動相是非常重要的。
正相色譜，例如鍵合聚乙二醇-400填料，一般采用己烷、庚烷、異辛烷、苯和二甲苯等作為流動相。往往還在非極性溶劑中加入一定量的四氫呋喃等極性溶劑。反相色譜大多使用甲醇、乙醇、乙腈、水-甲醇，水-乙腈作為流動相。絕大多數離子交換色譜在水溶液中進行。緩衝液作為離子平衡時的反離子源，使得流動相pH和離子強度不變。排阻色譜具有排阻和吸附的混合過程，因此可根據不同的分析對象選擇合適的流動相。
三、液相色譜的保留機理
樣品產生的電信號隨時間變化的曲線稱為色譜流出曲線。流出曲線上突出的部分稱為色譜峰。如果分離完全，每個色譜峰代表一種組分。根據色譜峰的位置（以保留值表示）可以定性，根據峰高（h）或峰麵積（A）可以定量，峰寬（以區域寬度表示）可用於衡量色譜柱效能。
色譜峰區域跨度（peak width）是流出曲線中一個很重要的參數，從色譜分離角度看，希望區域寬度越窄越好。通常度量色譜區域寬度有三種方法。
（1）標準偏差（σ） 即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半，即W1的一半。
（2）半峰寬度W1/2 即峰高一半處的色譜峰寬度，也稱為區域寬度、半寬度。
（3）基線寬度（Wb） 即通過色譜峰兩側的轉折點（拐點）所作的切線在基線上的截距。基線寬度和標準偏差的關係為：Wb=4σ。
基線，在實驗操作條件下，色譜儀沒有進樣時記錄器所記錄的圖線。
樣品（或溶質）在柱內保留或滯留的能力可以用保留值來描述，在相同的操作條件下，不同物質有各自固有的保留值，這一特征是色譜定性的基本依據。在高效液相色譜中，保留值主要有以下幾種表示法。
（一）保留時間(tR)和保留體積(VR)
從進樣開始到柱後出現樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間，用tR表示。在這段時間內衝洗劑（流動相）流過的體積為保留體積，用VR表示，它和衝洗劑的體積流量有關。
（二）調整保留時間(t′R)和調整保留體積(V′R)
tR和VR會隨著柱體積和填料的孔隙度而發生變化，應扣除“死時間”（t0R）和“死體積”（V0R）。扣除“死時間”和“死體積”後的保留值稱調整保留時間(t′R)和調整保留體積(V′R)。
（三）容量因子
容量因子（k′）是在色譜法中廣泛使用的保留值表示法。k′隻與溶質在固定相和流動相的分配性質、柱溫以及相空間比（固定相和流動相體積比）有關，而與柱尺寸和流速無關。某物質的k′定義為在分配平衡時該物質在兩相中的絕對量之比，即k′=物質在固定相的量qs物質在流動相的量qm。通過熱力學公式推導得到一個有實際應用價值的計算公式，k′=t′R/t0R。
（四）相對保留值和選擇性
相對保留值可以用來表示兩個組分的分離，α=t′R(2)/t′R(1)。在HPLC中，一定條件下測得的具有不同k′值物質的理論塔板數基本相同，因而可以用α′來考查相鄰兩峰的分離，α′=tR(2)/tR(1)，α′稱為選擇性。通過改變固定相的種類、柱溫以及流動相的組成來調節α或α′，以達到滿意的分離效果。
（五）柱塔板數N
Martin在1941年首次提出了色譜的塔板理論，他把色譜柱比作蒸餾塔。從統計結果看，在某一段柱長範圍內溶質在固定相和流動相之間達到分配平衡，這段柱長就相當於一個理論塔板的高度（H），並認為當色譜柱的理論塔板數足夠大時，柱內溶質譜帶的濃度分布遵守高斯方程。雖然塔板理論並未反映色譜過程的本質，但卻形象地描述了這個過程的主要特征，並給出了衡量色譜效率的指標——塔板高度和塔板數，因而塔板理論這個概念在色譜中沿用了幾十年。
峰寬是許多色譜方法好壞的指標，而塔板數N是衡量柱性能好壞的重要指標。計算塔板數可以有兩個方法。
一是測量峰高一半（h1/2）的半峰寬（W1/2），具體測量是從色譜峰的最高點到基線作垂線；取垂線的1/2處作與基線平行的線段。此線段為半峰寬（W1/2）。
二是測量峰底寬Wb。
理論塔板高度（H）為：
H=L/N
式中L——柱長
N——塔板數
考慮到樣品穿過柱內空隙體積時，並不與固定相發生質量交換，故也常使用扣除死時間的調整保留時間t′R來計算有效塔板數N有效和有效塔板高度H有效；
由此可見，當k′比較小的時候（例如k′＜0.1），H有效比H大得多（或N有效比N小得多）；而當k′比較大時（如k′＞5），則兩者相差就很小了。