3.2菌種提純
分離後，在培養初期必須判斷菌絲是否已被雜菌感染。為此，宜將萌發的一小段菌絲移接到新的培養基上，再次判斷是否有雜菌感染。如果已確定被汙染，可以使用下述混有抗黴劑或抗菌素的培養基或其他技術措施將汙染除去。
3.2.1選擇性培養基
從腐朽嚴重的木材塊上分離菌絲時，新生菌常會伴隨各種各樣的細菌、黴菌出現。這種情況可使用選擇性強的抗黴劑培養基，如多菌靈（MBC）。還有對細菌類有效的抗生素如四環素、氯黴素等加入培養基內，以抑製細菌的出現，加入量為30mg/L。抗黴劑使用濃度為5～10mg/L。此外，還可以在培養基內添加金黴素20～30mg/L、鏈黴素30～40mg/L或高錳酸鉀50mg/L。
3.2.2排除細菌性或酵母菌汙染
菌種分離操作複雜，分離物來自野生菌類或栽培場，因此，細菌性汙染幾率大，時常會出現黏稠狀或油滴狀的菌落。為了排除汙染，除孢子分離外，凡是采用組織分離、基內菌絲分離，均應將分離物接種在無冷凝水、硬度高（增加瓊脂用量至2.3%～2.5%）的斜麵上，再降溫至15～20℃。利用某些大型真菌在溫度較低時菌絲生長比細菌快的特點，用尖細的接種針切割菌絲的前端，轉接到新的斜麵培養基中培養，連續2～3次就能獲得純菌絲。也可以用接種鏟將斜麵汙染的細菌菌落鏟掉，打破試管，挑取基內菌絲，移入無冷凝水的培養基上，這種方法適用於菌齡較長，被好氣性細菌汙染的試管。
3.2.3排除黴菌汙染
分離後進行培養，一旦發現顏色明顯的黴菌小斑點從接種塊處形成，最好放棄。如由同一材料分離得來的各支試管都是如此，那就要重新分離。如黴菌僅出現在分離塊附近，是接種時無菌操作不嚴格造成的。如黴菌菌落剛出現孢子，孢子未成熟時，尚未變色，可采用菌絲切割法提純；如黴菌菌落顏色已加深，意味著眾多分生孢子成熟，稍一振動，孢子就會飄散在培養基表麵，再行前端切割術提純意義不大。如菌絲蔓延範圍較大，可將1%多菌靈濕濾紙塊蓋在黴菌菌落上，防止提純時，黴菌孢子擴散；然後用火焰滅菌過的接種鏟將分離物表層鏟掉，用另一接種針鉤取分離物位置下的基內菌絲，移入新的培養基。
3.2.4菌絲再提純
采用如前述切割法或基內菌絲挑取法，大多數能獲得菌絲，但也不能排除另一種菌絲混雜在其中，特別是采用菇木分離法時，這種危險性出現的幾率較高。為了保持其純度必須對菌絲再提純。
為了便於判斷分離培養後菌落的純度，將菌絲塊接入瓊脂培養皿內培養。如是純菌絲，培養後的菌落會逐漸向四周呈輻射狀散開，外緣十分整齊。如菌種不純，混有其他真菌，菌絲生長速度不一，菌落外緣參差不齊。另外，再提純時，可將菌落中生長速度較為一致的部分菌落用菌絲切割法提純。
4知識拓展
將有價值的子實體的局部組織或孢子移接在斜麵試管培養基上，獲得純培養菌絲的操作稱為菌種分離。食用菌的菌種分離分為孢子分離法、組織分離法和基內菌絲分離法三種。其中孢子分離屬有性繁殖過程，組織分離法和基內菌絲分離屬無性繁殖過程。
4.1孢子分離法
孢子是食用菌的基本繁殖單位，用孢子來培養菌絲體是製備食用菌菌種的基本方法之一。孢子分離法是利用子實體上產生的成熟有性孢子分離培養獲得純菌種的方法。孢子分離有以下幾種方法。
4.1.1種菇孢子彈射法
選擇群體生長勢強的優良個體，並要求特
征典型、外表清潔、成熟度適當、無病蟲危害的子實體作種菇。根據子實體的不同形態，采集孢子的方法有兩大類：
（1）整菇插種法這是傘菌類食用菌的孢子采集方法。將種菇經表麵消毒後，在無菌操作下插入無菌孢子收集器內，置適溫下讓其自然彈射孢子。在無菌條件下，將孢子稀釋成懸浮液，接種到PDA培養基上，萌發成純菌絲體。
（2）鉤懸法取成熟菌蓋的幾片菌褶或小塊耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳），用無菌不鏽鋼絲（或鐵絲、棉線等其他懸掛材料）懸掛於三角瓶內培養基的上方，勿使接觸到培養基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養、轉接即可。